桑樹MAPK基因家庭信息分析與功能研究.pdf

1、生物和非生物逆境脅迫因子（如病原侵害、干旱、高鹽和高低溫等）嚴重影響農作物的生長發(fā)育以及產量和品質。植物對脅迫應答響應是一個涉及基因、信號傳導途徑以及基因表達產物協同參與的過程，這個過程又分為到4個階段:植物對脅迫信號的感知、脅迫信號的傳遞、膜受體對脅迫信號的識別與傳導和相關抗逆基因的表達。在這其中，蛋白激酶是植物體內一類重要的調節(jié)酶，通過膜受體感知外界環(huán)境脅迫信號，引起細胞內一些離子和分子濃度改變，激活不同蛋白磷酸化途徑。而促分裂原活

2、化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，它是普遍存在于真核生物中的一類保守的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，在植物生長發(fā)育和多種生物、非生物脅迫信號轉導過程中起著關鍵作用。
　　桑樹是一種對環(huán)境有極強的適應性的多年生生態(tài)經濟樹種，具有耐鹽堿、耐旱、耐澇和耐寒等多種特性。但其逆境生理、生化和分子生物學研究極少。關于桑樹抗性的研究主要集中在抗性種子資源的篩選及抗性生理指標的測定，桑樹抗性基因

3、的研究并不多見。雖然MAPK在一些植物中已經被鑒定并驗證功能，但是在公共數據庫（如NCBI，EMBL等）中沒有桑樹MAPK的相關報道。隨著川?；蚪M的完成，使在全基因組水平分析桑樹MAPK抗性基因家族成為可能，這對于探明MAPK脅迫信號轉導調控機理以及植物對生物和非生物脅迫適應機制具有重要意義，為桑樹分子改良提供研究基礎。
　　本研究基于川桑基因組數據庫，利用生物信息學方法對預測的桑樹MAPK基因家族根據其氨基酸序列和保守基序進行

4、分類和系統(tǒng)發(fā)生分析，從中鑒定出47個桑樹MAPK(MnMAPK)家族基因:32個MnMAPKKK、5個MnMAPKK和10個MnMAPK基因。并對其中的10個MnMAPK基因的基因結構、上游啟動子保守元件、氨基酸保守序列及與其他植物中MAPK蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析;并對其克隆序列與川桑基因組數據庫進行比對分析;以生長2個月（高度約25cm）的湖桑幼苗為材料，對其進行不同的脅迫（高溫，低溫，高鹽和干旱）和信號分子(ABA，SA，H2O2

5、和MeJA)處理，通過qRT-PCR分析桑樹MAPK基因在不同脅迫誘導條件下的表達情況;基于脅迫誘導表達譜篩選出候選的MnMAPK6基因進行亞細胞定位，構建植物超量表達載體農桿菌介導轉化模式植物擬南芥，獲得轉基因擬南芥植株，對轉基因擬南芥進行高溫，干旱，高鹽，H2O2等處理，觀察其對轉基因植株的生長發(fā)育和非生物脅迫耐受情況。本研究的主要研究結果如下:
　　1、川桑MAPK基因家族生物信息學分析和克隆
　　利用生物信息學方法在

6、川桑基因組中鑒定得到47個桑樹MAPKs家族基因:32個MnMAPKKK、5個MnMAPKK和10個MnMAPK基因。并對其中的10個MnMAPK基因的基因結構、上游啟動子保守元件、氨基酸保守序列及與其他植物中MAPK蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析，克隆了10個MnMAPK基因，序列驗證發(fā)現川?；蚪M數據庫中MnMAPK2比川桑cDNA中克隆得到的MnMAPK2全長cDNA缺失15個核苷酸堿基，MnMAPK8存在兩種剪接形式。MnMAPK基因

7、CDS大小介于1107 bp到1902 bp之間，它們編碼的蛋白質大小范圍為368至633個氨基酸(aa)，預測的蛋白質分子量在42.4 kD和70.9 kD的之間，等電點大小介于5.0到9.28之間。通過桑樹MAPK氨基酸序列多重序列比與系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現，桑樹MAPK分布在A-E組。
　　2、桑樹MAPK基因非生物脅迫誘導表達分析
　　對川桑MAPK家族的10個基因設計qRT-PCR引物，以生長兩個月的湖桑32號幼苗為材

8、料，進行高溫、低溫、干旱、高鹽非生物脅迫處理和ABA、SA、H2O2和MeJA四種信號分子處理，提取對照組和處理組材料的RNA反轉錄為cDNA，檢測桑樹MAPK基因在脅迫處理條件下的表達情況。結果表明，桑樹MnMAPKs基因可以受到多種非生物脅迫的誘導，不同的桑樹MAPK基因對不同的脅迫處理有不同的脅迫應答模式。
　　3、川桑MnMAPK6基因亞細胞定位與功能研究
　　MnMAPK6在桑樹根、莖和葉三個組織在不同的非生物脅迫

9、和不同的時間段處理后的表達模式不同，可以響應多種脅迫，暗示MnMAPK6參與了桑樹非生物脅迫響應信號傳導途徑。
　　構建35 S-MnMAPK6∷ EGFP瞬時表達載體，同時構建35S-EGFP表達載體作為對照，用農桿菌侵染法轉化洋蔥表皮細胞，結果顯示MnMAPK6融合蛋白被定位在細胞核中。
　　構建MnMAPK6植物超量表達載體，浸花法轉化擬南芥并獲得轉基因植株。不同的過表達植株GUS的表達量不同，并且表現出一定的組織差異