玉米光周期敏感相關(guān)基因ZmCOL的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)具有豐富的遺傳變異,對(duì)其改良并利用可以拓寬中國玉米種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)、提升育種水平。然而,光周期敏感性嚴(yán)重限制了熱帶、亞熱帶種質(zhì)在溫帶的利用。因此,分離、克隆并研究玉米光周期敏感相關(guān)基因并揭示光周期敏感的遺傳特性和內(nèi)在分子機(jī)制,對(duì)熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)的有效利用具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　 本研究以光周期敏感自交系CML288和光周期鈍感自交系黃早4為材料,利用同源克隆的方法克隆了與擬南芥CO、水稻OsHd1同源

2、的玉米ZmCOL基因；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法研究了ZmCOL基因的晝夜表達(dá)模式,分析了不同發(fā)育時(shí)期葉片和莖尖中ZmCOL基因的表達(dá)情況及ZmCOL基因與ZmGI和Zm刀基因之間的表達(dá)關(guān)系；構(gòu)建了ZmCOL基因全長及保守結(jié)構(gòu)域的35S融合表達(dá)載體,對(duì)ZmCOL基因全長及保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究；構(gòu)建了ZmCOL基因的過量表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌浸染花序法轉(zhuǎn)化擬南芥,得到了轉(zhuǎn)基因一代植株；通過玉米光周期敏感相關(guān)性狀,對(duì)21份玉米自交系的

3、光周期敏感性進(jìn)行了初步鑒定,并結(jié)合這21份材料中ZmCOL基因的序列變異,分析了ZmCOL基因序列變異與玉米光周期敏感性狀的相關(guān)性。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用同源克隆等方法,成功克隆了玉米類ZmCOL基因。該基因序列含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子,CDS序列中含有1197/1188bp的開放性閱讀框,推測編碼一條含有398/395個(gè)氨基酸的肽鏈。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),ZmCOL與水稻OsHd1位于同一進(jìn)化分枝,其親緣關(guān)系最近,

4、同源性達(dá)87.10％。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其蛋白含有CO/Hd1基因典型的BBOX和CCT功能域,表明ZmCOL基因是CO/Hd1的同源基因。在光敏感材料CML288和光鈍感材料黃早4的ZmCOL基因的ORF中有一連續(xù)九個(gè)堿基的插入/缺失變異,該變異引起了ZmCOL蛋白序列的差異,推測該變異與玉米自交系的光周期敏感程度相關(guān)。
　　 2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究了ZmCOL基因在CML288和黃早4長短日照兩種處理?xiàng)l件下的晝夜節(jié)律表

5、達(dá)規(guī)律及其在不同部位、不同的發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律,分析了ZmCOL基因與擬南芥GI和刀的在玉米中的同源基因ZmGI、ZmFT的表達(dá)關(guān)系。結(jié)果表明:在長短日照處理?xiàng)l件下,與擬南芥CO和水稻OsHd1一樣,兩種玉米自交系中ZmCOL基因表達(dá)均表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性。ZmCOL基因在黃早4和CML288的葉片和莖尖中均有表達(dá),但在玉米的不同發(fā)育時(shí)期,ZmCOL基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出高低不同的動(dòng)態(tài)變化,其在莖尖和葉片中的表達(dá)高峰時(shí)期與玉米光周期誘導(dǎo)敏感期一

6、致,表咀ZmCOL基因可能在玉米的光周期誘導(dǎo)敏感期發(fā)揮作用,在該時(shí)期ZmCOL基因在不同敏感程度的自交系中的主要表達(dá)部位有所不同,在光鈍感材料中ZmCOL基因在葉片的表達(dá)量較高,而在光敏感材料中ZmCOL基因在莖尖的表達(dá)量較高,但ZmCOL基因在葉片中的表達(dá)量最終決定了玉米自交系材料能否正常完成光周期誘導(dǎo)敏感期的光周期誘導(dǎo)。基因間的表達(dá)關(guān)系研究表明,ZmG1基因位于ZmCOL基因的上游,調(diào)控ZmCOL基因的晝夜表達(dá)節(jié)律；ZmCOL基因位

7、于ZmFT的上游,在玉米發(fā)育的前期及光周期誘導(dǎo)敏感期發(fā)揮作用；而下游基因ZmFT,在玉米發(fā)育的后期即花發(fā)育敏感時(shí)期起調(diào)控作用。
　　 3.成功構(gòu)建了玉米ZmCOL基因的35S融合表達(dá)載體并通過基因槍轟擊,使其在洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá),結(jié)果表明,ZmCOL是一個(gè)核定位蛋白,其保守結(jié)構(gòu)域CCT是該基因唯一的一個(gè)核定位信號(hào),具有核定位功能；構(gòu)建了過量表達(dá)載體3301-221-ZmCOL,且將該基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥,對(duì)陽性候選轉(zhuǎn)基因的PCR鑒

8、定表明,已經(jīng)成功將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥。
　　 4.通過分析21份不同的玉米自交系的光周期敏感性及表型性狀與ZmCOL基因序列變異的相關(guān)性,結(jié)果表明,不同種質(zhì)類群的玉米自交系光周期敏感程度不同,其中熱帶種質(zhì)的自交系光周期敏感性最強(qiáng)；表型性狀的動(dòng)態(tài)聚類將不同玉米自交系光周期敏感程度劃分為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)四個(gè)等級(jí),隨著等級(jí)的升高,其含有的玉米自交系的光周期敏感性越強(qiáng)；ZmCOL基因序列變異位點(diǎn)2+(523-531)與光周期敏感相關(guān)