小黑麥耐鹽堿相關基因克隆及其功能驗證.pdf

1、目的：土地鹽漬化是嚴重影響農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境、限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的一個重要因素。鹽堿耕地上種植的作物表現(xiàn)為大幅的減產(chǎn)甚至死亡。目前，培育優(yōu)良的耐鹽堿作物品種是解決這一問題的方法之一。因此，應用分子生物學及基因工程手段培育耐鹽堿作物新品種已成為當前現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究的重要內(nèi)容之一。
　　 方法：本研究以六倍體小黑麥品種為主要研究材料，建立了小黑麥cDNA-AFLP技術，并以此為基礎篩選到與鹽脅迫相關的基因片段，采用RACE技術擴增到了碳酸

2、酐酶cDNA全長，通過半定量RT-PCR和酶活性分析技術對該基因和蛋白表達進行了分析，并利用農(nóng)桿菌介導法轉化擬南芥技術對該基因的功能進行了驗證。
　　 結果：
　　 1.利用cDNA-AFLP方法，采用64對引物從具有不同耐鹽堿性能的小黑麥鹽脅迫前后材料中篩選出了6個與耐鹽性密切相關基因片段，如與磷酸酰絲氨酸脫羧酶、碳酸酐酶、受體類激酶、光系統(tǒng)II32kDa蛋白、光系統(tǒng)I疏水蛋白（PSI），應激反應蛋白的cDNA差異片段

3、，首次在小黑麥育種上使用了cDNA-AFLP技術。
　　 2.以42號碳酸酐酶cDNA片段為基礎，通過RACE技術擴增到了小黑麥碳酸酐酶（CA）全長cDNA，其序列長為1114bp，基因BANK登錄號：GU145385，其中其 5′非編碼區(qū)為24bp，開放閱讀框長為778bp，3′非編碼區(qū)為310bp，編碼266個氨基酸。該小黑麥CA cDNA全長序列經(jīng)在NCBI中的同源性比對，與大麥的β-CA基因（登錄號：L36959.1）同

4、源性為 92％。經(jīng)Clustal x軟件對其蛋白質(zhì)結構預測表明，該CA基因所編碼的蛋白質(zhì)具有典型的β-CA基因家族的鋅原子的結合殘基，可初步斷定其為小黑麥β-CA基因。
　　 3.運用酶活性分析和半定量RT-PCR技術，對該小黑麥CA基因在蛋白和分子水平的表達進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)小黑麥幼苗葉片中的CA活性對鹽脅迫脅迫反應靈敏。在抗鹽性能不同的小黑麥品種間，CA活性對鹽脅迫的響應也存在著差異，表明小黑麥CA是一個鹽脅迫響應上調(diào)基因