玉米熱激轉錄因子ZmHsfA4a的抗旱功能研究.pdf

1、玉米是我國三大禾本科糧食作物之一，既可作為糧食，也可作為重要的工業(yè)原料，在保證糧食生產及糧食安全方面發(fā)揮重要作用。但是玉米在生長過程中，經常遭受一些不良環(huán)境因子的影響，從而導致其產量和品質的下降，其中最主要的是非生物逆境因子，如高溫、干旱及高鹽等。目前，通過轉基因技術進行作物遺傳改良、培育抗逆新品種以提高作物抗逆性，是保證糧食產量和品質的最為行之有效的方法之一。研究表明，轉錄因子在植物的抗逆應答過程中發(fā)揮重要調控作用，它們可以同時激活或

2、抑制多個下游基因的表達，效果更加顯著，目前在植物中很多轉錄因子基因被鑒定參與逆境應答反應。HSF是植物中重要的轉錄因子家族之一，廣泛參與到植物的生長發(fā)育及非生物逆境響應過程，在模式植物擬南芥及番茄中，HSF基因的作用機制已被研究清楚。然而，玉米作為重要糧食作物，其HSF基因的功能研究還未見報道，分子作用機制也不清楚。根據(jù)實驗室相關研究基礎，獲得了一個潛在與逆境相關的HSF基因ZmHsfA4a，通過基因表達、基因特征以及過表達分析對其抗旱

3、功能進行鑒定，并通過互作蛋白鑒定進一步闡明其作用機制。獲得的主要結果如下:
　　1.從玉米B73中克隆得到ZmHsfA4a全長CDS序列，測序結果與B73基因組數(shù)據(jù)庫公布序列完全一致，該基因全長1302bp，編碼433個氨基酸。基因芯片數(shù)據(jù)顯不ZmHsfA4a在玉米的各個組織中均有表達，其中在葉中表達水平較高，熒光定量PCR結果顯示ZmHsfA4a在檢測的六個組織，根、莖、葉、雄穗、花絲、及包被葉中均表達、且在葉中表達水平較高，這

4、與芯片數(shù)據(jù)基本一致。誘導表達分析結果顯示，ZmHsfA4a受到干旱和高溫誘導表達，而在ABA和NaCl處理下呈下調表達。
　　2.亞細胞定位結果顯示ZmHsfA4a-p1305融合蛋白只在細胞核中表達，表明ZmHsfA4a是一個核定位蛋白;轉錄活性分析結果表明，ZmHsfA4a在酵母AH109菌株中具有轉錄活性，并且主要活性區(qū)域位于230-280氨基酸之間。
　　3.構建過表達載體ZmHsfA4a-p1301a，通過農桿菌介

5、導轉化擬南芥。轉基因擬南芥在含有300mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率顯著高于野生型，且在干旱條件下，轉基因植株的耐受性增強。表達分析顯示，轉基因擬南芥中逆境相關基因在干旱處理之后的表達水平升高，并且高于野生型植株。
　　4.ZmHsfA4a過表達到水稻zhonghua11中，轉基因水稻對干旱抗性增強。干旱處理后，轉基因水稻植株的相對電導率及丙二醛含量顯著低于野生型植株，并且干旱處理后一些逆境相關基因的表達水平在轉基因植株中要高于野

6、生型植株，這些結果進一步表明ZmHsfA4a增強了轉基因水稻抗旱性。此外轉基因水稻對外源ABA的敏感性增加，說明ZmHsfA4a參與水稻ABA介導信號通路。
　　5.過表達ZmHsfA4a增加了轉基因玉米對干旱耐受性。相對失水率實驗表明轉基因植株相對于野生型植株的相對失水率較低，干旱處理后，轉基因玉米的相對電導率及丙二醛含量顯著低于野生型植株，但游離脯氨酸含量顯著高于野生型植株，這表明轉基因玉米抗旱性增強。對ABA含量測定發(fā)現(xiàn)，正

7、常情況下轉基因玉米與野生型植株沒有差異，干旱處理后轉基因玉米ABA含量顯著高于野生型植株，并且ABA合成相關基因ZmVP14的表達與ABA含量趨勢相一致，說明ZmHsfA4a參與了玉米ABA信號轉導途徑。BIFC和pulldown實驗結果表明，ZmHsfA4a可以自身相互作用形成同源多聚體，并且ZmHsfA4a可以與EMP2相互作用。
　　以上實驗結果表明，ZmHsfA4通過ABA介導信號轉導途徑參與干旱脅迫應答調控，同時EMP2