東亞飛蝗Parental RNAi技術(shù)體系建立以及hunchback基因功能研究.pdf

1、東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis(Meyen)是我國最重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一，從溫帶到熱帶都有分布，常爆發(fā)式為害，并能遠距離遷移。由于全球氣候異常、旱澇頻繁、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境變化和大量施用化學(xué)農(nóng)藥等多方面的因素，我國蝗害發(fā)生和成災(zāi)面積又有回升趨勢。而且，飛蝗是昆蟲神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和系統(tǒng)演化等方面研究的重要模式生物。近年來，在分子水平探索飛蝗的生命特征已逐漸成為熱點，已經(jīng)有大量的基因被克隆。因此，需要一種行之有

2、效的方法來解讀這些基因的功能。 本研究采用parentalRNAi方法來建立東亞飛蝗的基因功能研究技術(shù)體系，并用該方法研究東亞飛蝗hunchback基因的功能?，F(xiàn)將主要研究內(nèi)容和結(jié)果總結(jié)如下： ①hunchback基因的克隆 采用PCR、RT-PCR、RACE等方法克隆了東亞飛蝗的hunchback基因，并根據(jù)cDNA序列推導(dǎo)出氨基酸序列，分別登錄到GenBank，登錄號為DQ340870和ABC69039.1。

3、克隆到的東亞飛蝗hunchback基因cDNA序列長3774bp，開放閱讀框為5-2545，共編碼846個氨基酸，推測蛋白分子量為92.09kDa。Hunchback蛋白共有8個鋅指因子：氮端2個(NF-1、NF-2)、中間4個(MF-1、MF-2、MF-3和MF-4)和碳端2個(CF-1、CF-2)。除此之外，還有ABox、CBox和BasicBox等結(jié)構(gòu)域。 ②東亞飛蝗parentalRNAi 通過體外轉(zhuǎn)錄制備dsR

4、NA，將dsRNA直接注射到東亞飛蝗雌成蟲的血腔里。注射dsRNA后，所有的蝗蟲都存活下來，一周后開始陸續(xù)產(chǎn)卵。與對照相比，注射dsRNA蝗蟲的產(chǎn)卵量沒有明顯差異，說明dsRNA不影響蝗蟲的生殖力。 注射hunchbackdsRNA的胚胎，已基本上檢測不到hunchbackmRNA，而注射緩沖液空白組和無關(guān)gfpdsRNA分子的對照組則沒有明顯改變。與對照相比注射dsRNA胚胎的Hunchback蛋白含量下降了將近4倍，而β-t

5、ubulin蛋白沒有變化。說明RNAi特異性地抑制了內(nèi)源靶基因的沉沒，而沒有對其他基因的表達產(chǎn)生影響。 根據(jù)胚胎表型的嚴重程度，可以將hunchback基因沉默后的表型分為3類。 表型Ⅰ：頜、胸部體節(jié)發(fā)育正常，腹部嚴重縮短，胸足畸形，占8.4﹪。 表型Ⅱ：頜、胸部完全缺失，僅形成了前頭部和一個縮短的腹部，占86.0﹪。前頭部包括復(fù)眼、上唇和觸角，由于大面積組織缺失，兩個復(fù)眼長到了一起，形成典型的“Ⅴ”形復(fù)眼。腹部

6、僅形成了6-7個腹節(jié)，缺失了3-4個腹節(jié)。 表型Ⅲ：頜部、胸部和腹部完全缺失，僅形成前頭部，包括復(fù)眼、上唇和觸角，占1.9﹪。 ③RNAi作用的持續(xù)性 產(chǎn)下的第一個卵塊幾乎100﹪的都表現(xiàn)出RNAi表型，隨后產(chǎn)下的卵塊RNAi表型的比例逐漸下降，第5個卵塊已經(jīng)沒有RNAi作用。說明RNAi的抑制作用是持續(xù)的但逐漸減弱的，東亞飛蝗RNAi的抑制作用能夠持續(xù)15天左右。 ④東亞飛蝗RNAi的影響因素

7、劑量：本研究采用了20μg、2μg、0.2μg和0.02μgdsRNA/蟲四個梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著劑量的降低RNAi的作用迅速減弱，20μg和2μgdsRNA/蟲幾乎100﹪都產(chǎn)生RNAi表型，而0.02μgdsRNA/蟲的劑量不能產(chǎn)生RNAi作用。說明dsRNA分子抑制hunchback基因具有劑量依賴性。 注射時間：本實驗從第5齡末的若蟲到羽化后第13天的成蟲，均注射相同劑量的dsRNA(20μgdsRNA)，每種處理至少做5

8、個重復(fù)，結(jié)果僅第7天的成蟲產(chǎn)生了RNAi作用。 不同長度dsRNA：本研究中注射了4個長度分別為211、357、533和1085bp的dsRNA，結(jié)果處理之間沒有顯著差異。說明dsRNA的長度對RNAi的作用沒有明顯的影響。 ⑤hunchback基因的功能 東亞飛蝗hunchback基因的parentalRNAi產(chǎn)生了3種表型，其中表型Ⅱ的頜部、胸部完全缺失，最嚴重的表型Ⅲ僅形成了前頭部，包括觸角、復(fù)眼和上唇，其

9、余部分全部缺失。表明東亞飛蝗hunchback基因在頜部和胸部區(qū)域起著典型的間隙基因的功能，調(diào)控頜、胸部體節(jié)的形成。 RNAi使腹部發(fā)育產(chǎn)生嚴重缺陷，表現(xiàn)為腹節(jié)缺失，僅形成6-7個腹節(jié)，或腹部僅形成一團紊亂的組織，沒有形成明顯的腹節(jié)。因此，hunchback基因不但是腹部伸長生長的需要，也是腹部分節(jié)所必須的調(diào)控基因。 ⑥hunchback功能的進化 Hunchback蛋白是含有鋅指因子的轉(zhuǎn)錄因子，中間鋅指因子(M