東亞飛蝗海藻糖合成酶基因的克隆與功能研究.pdf

1、海藻糖在細(xì)菌、真菌、昆蟲、無脊椎動(dòng)物等大量生物中都存在，它不僅可以作為碳源和能源的主要來源，而且在抵抗高溫、低溫、缺水等逆境方面起著重要的作用。海藻糖合成酶（TPS）是海藻糖合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。有關(guān)細(xì)菌和真菌的海藻糖合成酶的報(bào)道已經(jīng)比較多，大量編碼海藻糖合成酶的cDNA序列也得到了克隆。但是昆蟲中只有少數(shù)幾個(gè)物種的海藻糖合成酶基因的cDNA序列得到了克隆，有關(guān)其功能的報(bào)道更是少數(shù)。我們從東亞飛蝗Locusta migratoria

2、manilensis的脂肪體中克隆得到了海藻糖合成酶基因，并對(duì)其組織表達(dá)和功能進(jìn)行了初步研究，取得了如下進(jìn)展：
　　①東亞飛蝗海藻糖合成酶（LmTPS）基因的克隆
　　通過RACE方法，克隆了東亞飛蝗海藻糖合成酶（LmTPS）cDNA全序列（登錄號(hào)：EU131894）。獲得的cDNA全長(zhǎng)2806bp，其中包括2442bp的開放閱讀框，共編碼813個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量和等電點(diǎn)分別為91976D和6.14。該氨基酸序列和已經(jīng)公

3、布的其他昆蟲的海藻糖合成酶基因有很高的相似性，并且它的C端與海藻糖磷酸化酶（TPP）基因也有著高度同源區(qū)域。
　?、贚mTPS基因的組織表達(dá)分析
　　本研究通過半定量RT-PCR研究LmTPS的組織表達(dá)情況，分別取五齡幼蟲的脂肪體、腸道、血液和腿部肌肉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，海藻糖合成酶不僅在蝗蟲的脂肪體中表達(dá)，而且在腸道、血液和腿部肌肉中都有轉(zhuǎn)錄。
　?、蹡|亞飛蝗的RNAi
　　根據(jù)得到的cDNA序列設(shè)計(jì)了一段90

4、2bp的片段，體外轉(zhuǎn)錄成dsRNA后注射東亞飛蝗，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，海藻糖濃度從第4天開始明顯下降，并且持續(xù)到第14天。海藻糖的這種變化很可能是由LmTPS的轉(zhuǎn)錄水平降低引起的。
　　④釀酒酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)
　　為了對(duì)克隆得到的海藻糖合成酶 cDNA序列進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證，我們用PFL61載體將得到的cDNA序列轉(zhuǎn)入釀酒酵母海藻糖合成酶基因tps1缺失突變株YSH290，結(jié)果使得它在葡萄糖培養(yǎng)基平板上無法生長(zhǎng)的性狀得到了

5、恢復(fù)，說明LmTPS可以部分或完全的在釀酒酵母中發(fā)揮海藻糖合成酶的功能。
　?、軱mTPS在畢赤酵母中的表達(dá)
　　將 LmTPS基因編碼框連接到表達(dá)載體 pPIC9K的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建了pPIC9K-LmTPS重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母表達(dá)菌株KM71，PCR方法檢測(cè)重組情況，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子在甲醇的誘導(dǎo)下表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物上清液中檢測(cè)到了約91kD的目的條帶，說明LmTPS基因可能在上清液中得到了表