以玉米幼胚為受體轉(zhuǎn)化海藻糖合成酶基因.pdf

1、干旱是玉米生產(chǎn)的主要限制因素之一。玉米自身的水分生理狀況也決定了它比其他禾本科作物更易受干旱危害。盡管玉米不同基因型間存在一定的耐旱性差異，但耐早性受微效多基因控制，遺傳機(jī)制復(fù)雜，傳統(tǒng)的遺傳改良難度較大。因此，借助轉(zhuǎn)基因方法，將外源耐旱基因轉(zhuǎn)入玉米，可能是有效提高玉米耐旱能力的快捷方法。 近年來耐旱基因研究取得了較快進(jìn)展，相繼克隆了一些重要的耐旱基因，試圖提高其耐旱性，但因這些基因耐旱能力不夠強(qiáng)，耐旱機(jī)制與玉米生理代謝不協(xié)調(diào)等原

2、因，轉(zhuǎn)基因后代的耐旱性不能達(dá)到玉米生產(chǎn)要求(宋松泉等，2000；王關(guān)林等，2002；宋風(fēng)斌等，2005)。因此需要探索利用耐旱能力更高，適宜玉米生理代謝機(jī)制與生產(chǎn)要求的耐旱基因，海藻糖合成酶基因TPS1就是其中之一。TPS1合成的海藻糖在干旱條件下通過氫鍵與氨基酸相連，可以代替水起到防止蛋白質(zhì)變性和細(xì)胞融合的作用(Crowe等，1992)。如果利用海藻糖的抗逆耐旱特性，采用基因工程將其相關(guān)酶的基因轉(zhuǎn)入玉米等作物，進(jìn)而培育耐旱抗逆新品種，

3、這對于植物遺傳改良具有重要意義。 常用的玉米轉(zhuǎn)基因方法多以胚性愈傷組織作為外源基因受體，而胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和分化再生，嚴(yán)重受到基因型的限制，只有極少數(shù)材料能穩(wěn)定高效誘導(dǎo)胚性愈傷組織，加之胚性愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間長，操作繁瑣，分化再生率不高等原因，嚴(yán)重制約了玉米轉(zhuǎn)基因研究的進(jìn)展。因此，有必要開展其他轉(zhuǎn)基因方法研究，以提高轉(zhuǎn)化效率。為此，本試驗(yàn)開展了以玉米幼胚為受體、用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將釀酒酵母海藻糖合成酶基因TPS1轉(zhuǎn)化玉米的研究，結(jié)果

4、如下： 1)以幼胚為受體轉(zhuǎn)化外源基因，可縮短轉(zhuǎn)化過程。以幼胚為轉(zhuǎn)化受體，與含外源基因的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，不經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)和篩選，直接再生植株，減少基因型對愈傷組織為受體的轉(zhuǎn)基因限制，避開組織培養(yǎng)的繁鎖過程，縮短轉(zhuǎn)化程序。 2)以幼胚為受體轉(zhuǎn)化外源基因的優(yōu)化體系。由于幼胚對農(nóng)桿菌浸染更敏感，尤其是褐化率比愈傷組織更高，造成轉(zhuǎn)基因失敗，為此試驗(yàn)通過對幼胚大小和抗褐化劑半胱氨酸(Cys)的濃度篩選，發(fā)現(xiàn)長度在1.5～2.0mm

5、的幼胚更適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)的幼胚轉(zhuǎn)化，并且在農(nóng)桿菌與幼胚的共培養(yǎng)階段添加200mg/L的半胱氨酸，能夠有效降低幼胚在農(nóng)桿菌浸染過程中的褐化率(29.3％)，比對照褐化率(53.7％)減少約一倍。 3)通過PCR檢測，初步發(fā)現(xiàn)外源基因已轉(zhuǎn)入受體。將轉(zhuǎn)基因再生植株移栽后，生長至5葉期，每株取一小塊葉片，按5株組成一個(gè)混合樣，提取DNA，進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，有目的條帶的再分單株檢測，最后得到1株陽性轉(zhuǎn)基因植株。按混樣檢測法可以提高陽性植株