rnai用于基因功能的鑒定和確證

1、,RNAi(shRNA/miRNA)用于基因功能的鑒定和確證,廣州復能基因有限公司李華平博士 研發(fā)部主任,FulenGen,FulenGen,Gene Function Screening,Mechanism of RNAi (shRNA/miRNA),Comparison of shRNA and miRNA properties,Architecture s

2、hort hairpin Single-strandOriginal Exogenous EndogenousNo. of intended target 1 ManyDegree of

3、gene silence High LowComplementary to mRNA target Perfect ImperfectEffect on mRNA Endonucleolytic cleavage Repressed

4、translation,shRNA miRNA,FulenGen,FulenGen,shRNA的設計與構建 shRNA的驗證 miRNA的克隆與檢測 miRNA靶標的確證 基因沉默后的功能拯救,FulenGen,FulenGen,shRNA 表達克隆的構建,載體選擇 篩選標記和報告基因 目的細胞,shRNA序列設計 高準確性的預測方法

5、 莖和環(huán)序列,有效性檢測 3-5個shRNA /基因 目的基因是否表達,克隆和測序 合成引物的長度 莖環(huán)結構難以有效測序,保證高表達抑制效率和最低的脫靶效應； 慢病毒載體和以哺乳動物細胞表達載體；序列已經過測序；每個基因提供4個克隆，至少有1抑制水平達到70%以上提供包含不規(guī)則序列的陰性對照克隆來比較研究。,OmicsLink? shRNA表達克隆,FulenGen,經過

6、驗證的人類激酶組shRNA表達克隆 350個人類激酶基因的確證shRNA表達克隆 表達抑制效應都經過驗證，達70％以上 低的脫靶效應。,FulenGen,shRNA克隆用于信號通路研究,qPCR Primer array 即將上市,采用先進的算法，精心設計的qPCR引物 擴展長度100－250bp； PCR擴展效率>90%； 每對引物的都經過擴展曲線、溶解曲線

7、和電泳檢測，包括擴展的特異性,,,,,,,,ExonicNon-coding,MicroRNAs 由RNA Polymerase II轉錄,IntronicNon-codingand coding,Lee, et al., EMBO J. 23:4051-60 2004,/~-OH,mature and primary microRNA 的結構,Pri-miRNA,Drosha Cleavage site,Mature,,,Ve

8、ctor-Based microRNA Expression Clones,FulenGen,III 型啟動子,II 型啟動子,Vector-Based microRNA Expression Clones,FulenGen,OmicsLink? Human Precursor miRNA Expression Clones,,pEZ-MR02,650種前體miRNA表達克隆涵蓋了miRBase（11.0版本）中已知的678種miRNA

9、的95% miRNA表達框已完全測序確證 基于慢病毒載體系統(tǒng)的表達克隆可轉染未分化細胞和難轉化的細胞，獲得與普通分化細胞類似的轉染效率 提供被轉染細胞的存活性的篩選基因，可用于穩(wěn)定或瞬時表達調控 通過應用eGFP可以監(jiān)測病毒和質粒載體的轉染效率,FulenGen,miRNA與腫瘤,miRNA的檢測和定量,檢測方法 Nothernblot Microarray Quantitative Real-time PCR,檢測對象

10、 Primary-miRNA Pre-miRNA Mature miRNA,FulenGen,Quantitative Real-time PCR detect miRNA,polyA加尾法,Loop反轉錄法,通用性高；適用于同一樣本檢測多種miRNA經濟、方便,特異性高；適用于多個樣本中檢測同一miRNA價格較高,FulenGen,qPCR 檢測miRNA的特異性,qPCR檢測miRNA的特異性,qPCR 檢測miRNA困

11、難,采用LNA探針,miRNA Target的分析,研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中，miRNAs的基因抑制作用是通過其5’一段長為6－8nt的核苷酸與mRNAs3’端非翻譯區(qū)域相結合實現(xiàn)的。一般這段核苷酸位于 miRNA序列5’的2~8個nt，被稱為seed區(qū)。2007年，美國約翰·霍普金斯大學發(fā)現(xiàn)miR-29b 5’的6個核苷酸與該miRNA的細胞定位有關。,FulenGen,miRNA 5’的seed區(qū)域在miRNA家族中具有很

12、高的保守性，對脊椎動物的miRNA target的識別具有重要的作用，尤其是第2-8個堿基。,FulenGen,針對HDAC5的三個不同版本的算法的microRNA的預測結果,紅色表示第三和第四版重疊的microRNA，黃色表示第四和第五版重疊的microRNA,,,microRNA,Translation,DegradeationOr Translation inhibition,Light,No Light,Renilla Luc

13、iferase data,Firefly Luciferase data,miRNA的編輯及其靶標的變化,miR376a-5p 經過編輯后，其靶標的變化,FulenGen,OmicsLink? Human miRNA Target Sequence (3’ UTR) Expression Clones,pEZX-MT01,pEZX-MT02,FulenGen,Gaussia luciferase expression in CHO ce