桃PpERS1、PpADC基因克隆、鑒定及PtADC轉(zhuǎn)基因功能分析.pdf

1、桃樹是全球廣泛栽培的重要果樹之一。新品種的選育和推廣應(yīng)用是促進(jìn)桃產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)?；蚬こ碳夹g(shù)由于目的性強、時間短等優(yōu)點使其成為當(dāng)前育種學(xué)家常用的手段之一，發(fā)掘植物體內(nèi)的優(yōu)良基因資源是應(yīng)用基因工程技術(shù)創(chuàng)造植物新種質(zhì)的必要前提。桃果實獨特的成熟衰老進(jìn)程，以及果實成熟期的生理生化物質(zhì)代謝機制研究的深入，使桃樹成為果樹植物中研究成熟和基因組分析的模式植物。同時，桃樹對土壤條件要求不太嚴(yán)格，栽培地域限制較小，為育種學(xué)家培育抵抗多重逆境脅迫

2、的植物新品種提供了良好的種質(zhì)資源。本研究從桃中成功克隆到PpERS1和PpADC基因及其啟動子，并對它們進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因功能驗證，同時通過驗證柑橘PtADC基因在轉(zhuǎn)基因番茄抗旱過程中的功能，拓展了ADC基因在植物體內(nèi)的分子生物學(xué)功能。主要結(jié)果如下：
　　 1.采用同源序列法從桃樹葉片中克隆到乙烯受體基因PpERS1，基因序列包含1935 bp的開放閱讀框，編碼644個氨基酸。其編碼蛋白質(zhì)分子量預(yù)測為72.4kDa，等電點為6.33。

3、多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明PpERS1屬于乙烯受體基因家族的ETR1亞家族，與薔薇科植物的ERS1基因具有高度的同源性。生物信息學(xué)分析表明PpERS1基因開放閱讀框含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，此外，基因5UTR序列中含有2個內(nèi)含子，第1個內(nèi)含子存在選擇性剪切機制。基因表達(dá)分析表明PpERS1基因在桃樹根、莖、功能葉片、花、幼果和成熟果實中均能表達(dá)，其中根組織中PpERS1基因的表達(dá)量最低，莖、功能葉片、花、幼果和成熟果實中PpERS

4、1基因表達(dá)量分別是根組織的1.5、1.8、2.4、1，5和4.3倍。逆境脅迫條件下，PpERS1基因受到傷害、脫水、乙烯利、高鹽和桃流膠病菌侵染的誘導(dǎo)表達(dá)，受到低溫處理的抑制表達(dá)。
　　 2.應(yīng)用染色體步移技術(shù)克隆到PpERS1基因啟動子，其全長為2798 bp。5'RACE結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄起始位點為G堿基，位于翻譯起始位點ATG上游-777 bp處，生物信息學(xué)分析表明啟動子序列含有典型的TATA box和CAAT box，并且含有

5、乙烯、傷害和增強子響應(yīng)元件，以及生長素、分裂素、脫落酸和赤霉素等激素響應(yīng)元件，干旱、低溫、病原菌等逆境脅迫響應(yīng)元件。通過構(gòu)建啟動子全長和5，端系列缺失的GUS植物表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄，GUS組織化學(xué)染色和熒光定量分析均表明啟動子具有正常的啟動子活性，并且啟動子序列中內(nèi)含子缺失不影響正常的啟動子活性。不同組織器官和發(fā)育階段GUS染色結(jié)果表明啟動子在轉(zhuǎn)基因番茄的根、莖、葉、花和果實中均能正常表達(dá)，在種子萌發(fā)過程中的胚根

6、、上胚軸、子葉和真葉中也能正常表達(dá)，同時受到傷害處理誘導(dǎo)表達(dá)，GUS定量分析表明啟動子受到傷害和乙烯利誘導(dǎo)表達(dá)，受到低溫抑制表達(dá)，高鹽處理不影響啟動子的活性。
　　 3.采用同源序列法從桃中克隆到精氨酸脫羧酶基因PpADC，基因全長包含2178bp的開放閱讀框，編碼725個氨基酸。其編碼蛋白質(zhì)分子量預(yù)測為77.7 kDa，等電點為5.19。多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明PpADC與蘋果等薔薇科植物的ADC基因具有高度的同源性。生

7、物信息學(xué)分析表明PpADC基因沒有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。逆境脅迫條件下，PpADC基因受到脫水、乙烯利、高鹽和低溫處理的誘導(dǎo)表達(dá)。將PpADC基因超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化番茄Micro-Tom，轉(zhuǎn)基因植株中PpADC基因超量表達(dá)，內(nèi)源腐胺、亞精胺和精胺含量相對于野生型番茄明顯提高，轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育遲緩、開花期延遲，外源施用赤霉素能有效恢復(fù)轉(zhuǎn)基因植株生長勢，基因表達(dá)分析表明轉(zhuǎn)基因植株部分赤霉素合成相關(guān)基因表達(dá)明顯受到抑制。
　　 4.應(yīng)用染色體步

8、移和電子克隆技術(shù)獲得PpADC基因啟動子，其全長為2043 bp。生物信息學(xué)分析表明啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點為A堿基，位于翻譯起始位點ATG上游-453 bp處，其序列含有典型的TATA box，并且含有干旱、低溫、病原菌等逆境脅迫響應(yīng)元件，以及生長素、傷害和生物鐘調(diào)控響應(yīng)元件。通過構(gòu)建啟動子全長和5'系列缺失的GUS植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄，GUS組織化學(xué)染色分析表明PpADC啟動子具有正常的啟動子活性。
　　

9、 5.PtADC轉(zhuǎn)基因功能分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因番茄中PtADC基因超量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源腐胺和亞精胺含量相對于野生型番茄明顯提高，但內(nèi)源精胺含量沒有明顯變化。離體葉片脫水處理過程中轉(zhuǎn)基因植株的失水率明顯低于野生型番茄。處理結(jié)束時，形態(tài)學(xué)觀察表明野生型番茄離體葉片相對于轉(zhuǎn)基因植株明顯萎蔫，轉(zhuǎn)基因植株離體葉片的相對電導(dǎo)率明顯低于野生型番茄，而葉綠素含量與相對電導(dǎo)率表現(xiàn)相反結(jié)果，并且NBT和DAB染色結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株ROS含量明顯低于野