紫莖澤蘭基因EaC4H的克隆及化感相關基因功能分析.pdf

1、紫莖澤蘭作為世界性入侵雜草在中國被認定為外來入侵物種之首，自從上世紀40年代傳入中國之后已經對中國的生態(tài)和經濟造成極大影響。目前國內外對于紫莖澤蘭的研究主要集中在其入侵模式、生態(tài)學特性、防除方法和利用等方面。紫莖澤蘭化感物質在生物入侵過程中發(fā)揮了重要的作用，其作用機制可能是通過影響植物光合作用、各種代謝以及根系生長和對礦質元素吸收等許多方面來實現入侵。然而目前，對于與次生代謝相關的化感物質的代謝調控機理方面的研究還很少，本文就是圍繞這一

2、點開展研究工作。本文擬針對與紫莖澤蘭化感相關的代謝途徑中相關基因進行克隆和功能分析，為紫莖澤蘭的綜合治理提供理論依據，以期能夠找到調控化感物質代謝的關鍵酶的編碼基因，發(fā)掘一些能夠為農業(yè)生產所利用的新基因。本論文的研究結果如下:
　　通過RACE技術，首次克隆了紫莖澤蘭肉桂酸四羥化酶基因的全長(GenBankID:KF751239)，將其命名為EaC4H。EaC4H全長1882bp，最大開放閱讀框架1518bp，推斷其編碼505個氨

3、基酸，預測該蛋白分子量為57.8，等電點PI為9.2。該蛋白具有P450結構域。根據EaC4H基因的3’非翻譯區(qū)序列設計引物，進行Real-TimePCR檢測，結果發(fā)現:經過不同濃度羥基澤蘭酮處理，EaC4H基因的表達水平出現不同程度上調。Southern blot分析表明該基因在紫莖澤蘭中至少有5個拷貝;洋蔥細胞的瞬時表達顯示，EaC4H蛋白具有細胞核定位功能。
　　為探討紫莖澤蘭CHS(EaCHS)基因和C4H(EaC4H)基

4、因功能，試驗分別構建EaCHS和EaC4H基因的植物過表達載體和干涉載體，并利用葉盤浸染法將構建的植物表達載體轉入到煙草NC89中，分別獲得上述兩基因的煙草干涉和過表達轉化植株。
　　實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術檢測EaCHS基因煙草轉化植株化感代謝途徑中關鍵酶基因的表達量并測定了煙草中化感物質總酚和類黃酮的含量。試驗結果表明:與野生型煙草相比，EaCHS過表達煙草的化感代謝途徑關鍵酶基因CHS，CHI，C4H, PAL

5、，4CL，F3'H，DXR，HMGR，TS，相對表達量均極顯著性上調(P＜0.01)，總酚和類黃酮的含量也相應顯著性增加(P＜0.01); EaCHS干涉煙草化感代謝途徑中關鍵酶基因的相對表達量均下調(P＜0.05)，同時總酚和類黃酮的含量也相應降低(P＜0.05)。
　　實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測EaC4H過表達轉基因煙草T1代葉片中C4H基因表達量比野生型煙草上調近21倍，但其他被檢測相關酶CHS，CHI, C4H

6、，PAL，4CL，F3H, DXR，HMGR和TS表達量卻呈不同程度下調趨勢，EaC4H的干涉轉基因煙草T1代葉片中上述各被檢測酶基因表達量與C4H均呈下調趨勢。HPLC檢測轉基因煙草葉片中C4H的活性與C4H基因表達量呈相應變化趨勢，但次生代謝物總酚和類黃酮含量均低于野生型煙草。
　　鹽脅迫和干旱脅迫條件下，EaCHS過表達轉基因煙草種子萌發(fā)率高于野生型和干涉型，葉綠素（Chlorophyll），丙二醛(MDA)、超氧陰離子(O

7、2-)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的等生理指標的檢測表明EaCHS過表達轉基因煙草的耐鹽和耐干旱性能也得到明顯提高，但EaCHS干涉轉基因煙草的種子萌發(fā)對鹽和干旱脅迫敏感高于野生型，幼苗的耐鹽和耐干旱性能明顯降低。EaCHS基因在煙草中表達量提高之后，提高植物對逆境的適應性，由此推斷該基因可能為植物在逆境（干旱，鹽）中的生存提供幫助。
　　鹽脅迫和干旱脅迫條件下，EaC4H過表達和干涉型轉