Pcd86-rae-1ε轉基因小鼠的深入鑒定及細胞免疫功能分析.pdf

1、機體的天然免疫和獲得性免疫緊密聯(lián)系，NK細胞與樹突狀細胞(DC)之間的對話(crosstalk)不僅影響天然免疫功能，對獲得性免疫的形成、發(fā)展及結果有深遠的影響。DC通過直接接觸NK細胞及分泌細胞因子激活NK細胞，并通過上調NK細胞的活性而增強其抗腫瘤作用。同時活化的NK細胞可以激活DC，進一步影響T細胞的活化及是否向Th1方向發(fā)展，從而最終影響機體的免疫防御和免疫監(jiān)視功能。
　　 在DC與NK細胞之間的相互作用中，DC表面MI

2、CA分子(或其他NKG2D配體)與NK細胞表面NKG2D受體之間的相互作用，不僅直接介導兩者之間的對話，并在MICA陽性腫瘤患者體內發(fā)揮著激活NK細胞，誘導DC吞噬凋亡腫瘤碎片并交叉遞呈抗原、啟動特異性免疫應答的作用。但若DC表面持續(xù)高表達NKG2D配體，對NK細胞具有怎樣的影響，目前尚不清楚。
　　 為此，我們制備了DC細胞持續(xù)表達MICA(小鼠為RAE-1ε)分子的pCD86-RAE-1ε轉基因小鼠，并完成基因整合的初步篩選

3、。本研究主要對轉基因小鼠進行RAE-1ε蛋白表達和組織分布的鑒定，以及相關細胞免疫功能分析。研究內容主要分為以下兩個部分：
　　 第一部分：pCD86-RAE-1ε轉基因小鼠的蛋白表達鑒定
　　 目的：進一步明確10只PCR鑒定陽性小鼠體內RAE-1ε蛋白的表達情況。
　　 方法：猝死小鼠，收取小鼠肺臟、肝臟、胸腺、腸等組織，通過Western Blot鑒定小鼠肝臟組織是否表達RAE-1ε，免疫組織化學技術檢測各

4、組織內RAE-1ε的表達情況，并利用流式細胞儀進一步鑒定脾臟單細胞懸液內DC、B細胞、巨噬細胞的表達情況。并在此基礎上，對陽性轉基因小鼠進行常規(guī)的交配傳代及常規(guī)PCR鑒定。
　　 結果：1)在10只F0代轉基因小鼠中，得到抗原遞呈細胞表面持續(xù)表達RAE-1ε蛋白的3只小鼠；2)3只陽性轉基因小鼠傳代到F4代，后代總的陽性率為51.69％以上，有望得到pCD86-RAE-1ε純合子轉基因小鼠。
　　 結論：通過基因整合和蛋

5、白表達水平的篩選，獲得3只親代小鼠，其交配的子代小鼠可于后續(xù)的相關研究。
　　 第二部分：pCD86-RAE-1ε轉基因小鼠的細胞免疫功能分析
　　 目的：觀察抗原遞呈細胞持續(xù)表達RAE-1ε對相關細胞免疫功能的影響。
　　 方法：首先觀察陽性小鼠的生命體征，并取轉基因小鼠脾臟、淋巴結制備成單細胞懸液，流式細胞術分別檢測NK細胞和CTL細胞數目占總淋巴細胞的比例，表面受體NKG2D的表達，殺傷靶細胞活性，分泌IF

6、N-γ的能力。同時檢測CD4+T細胞的比例及表面NKG2D的表達情況。其次，取轉基因小鼠脾臟來源的抗原遞呈細胞(高表達RAE-1ε)，刺激野生型小鼠NK細胞和CTL細胞，流式細胞術檢測細胞表面NKG2D受體表達、細胞毒活性及分泌IFN-γ的能力。最后，通過ELISA法比較轉基因小鼠與野生型小鼠血清內sRAE-1ε和RAE-1ε抗體含量的差異。
　　 結果：除部分陽性轉基因小鼠出現脫毛癥狀外，未發(fā)現其他相關的異常生命體征。NK細胞

7、和CTL細胞頻率均未見明顯變化，且其細胞表面NKG2D的表達明顯上調，細胞的殺傷活性及分泌IFN-γ的能力均發(fā)生顯著性升高；CD4+T細胞頻率未發(fā)生改變，但表面NKG2D的表達明顯上調。利用高表達RAE-1ε的抗原遞呈細胞刺激野生型小鼠淋巴細胞，其CTL細胞表面NKG2D表達、細胞毒活性及分泌IFN-γ的能力均未發(fā)生明顯改變；而NK細胞分泌IFN-γ的能力雖然未發(fā)生改變，但其NKG2D表達和細胞毒活性均明顯上調。這提示高表達RAE-1ε