甜菜抗線蟲(chóng)基因Hs1--2鑒定及禾谷孢囊線蟲(chóng)RNAi致死基因功能分析.pdf

1、甜菜(Beta vulgaris L.)是重要糖料作物，世界范圍內(nèi)約四分之一糖料來(lái)源于甜菜。甜菜孢囊線蟲(chóng)(BCN，Heterodera Schachtii Schmidt)是甜菜生產(chǎn)上的重要病害，造成的產(chǎn)量損失達(dá)25-50％?？剐杂N是甜菜孢囊線蟲(chóng)防控的主要方式。最有效的甜菜抗病資源為野生甜菜Patellifoliaprocumbens，甜菜抗病易位系TR363和TR520帶有來(lái)自其1號(hào)染色體的易位片段也具有甜菜孢囊線蟲(chóng)抗病性。但是只有

2、TR520帶有之前克隆的抗病基因Hs1prol，并且Hs1prol只有部分抗病性，因此在兩個(gè)易位系的共有區(qū)域內(nèi)一定存在第二個(gè)抗病基因，命名為Hs1-2。
　　通過(guò)γ-射線照射TR520，將易位片段打斷，從中篩選獲得兩個(gè)感病易位系TR320及TR659。Hs1-2位點(diǎn)應(yīng)位于兩個(gè)抗病易位系TR363和TR520易位片段的共有區(qū)域，而不存在于感病易位系TR320及TR659攜帶的易位片段上。
　　本研究的主要目的是通過(guò)第二代測(cè)序技

3、術(shù)對(duì)TR520、TR363及TR659進(jìn)行全基因組測(cè)序，從而找到Hs1-2位點(diǎn)。共獲得了1，822，146，316讀長(zhǎng)序列，經(jīng)過(guò)扣除法的生物信息分析，去掉屬于感病品種的序列，最終將Hs1-2位點(diǎn)定位到375kbp范圍內(nèi)。來(lái)自TR520的RNA-seq數(shù)據(jù)映射到這一區(qū)域，從中篩選了10個(gè)基因進(jìn)行下一步分析。
　　以TR520植株在線蟲(chóng)侵染后3、7、15及25天的根組織為材料，應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)篩選的10個(gè)基因的表達(dá)量變化，結(jié)果表

4、明ORF901、ORF903、ORF906及ORF910的表達(dá)量在線蟲(chóng)侵染后7dpi及15dpi顯著下降。ORF902含有2個(gè)鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與鈣調(diào)磷酸酶B類基因(CBL)高度同源，在線蟲(chóng)侵染后7dpi上升表達(dá)。ORF904與MAP3K蛋白激酶基因具有較高相似度，并且在線蟲(chóng)侵染后3dpi上升表達(dá)，因此，ORF902及ORF904篩選為Hs1-2位點(diǎn)的抗病候選基因，可能參與線蟲(chóng)抗病性的早期反應(yīng)。ORF905類似于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子(bZ

5、IP)，bZIP類轉(zhuǎn)錄因子在水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，能夠增加作物的抗逆性，并且ORF905在線蟲(chóng)侵染后的3dpi、7dpi及15dpi均上升表達(dá)。ORF908類似于一個(gè)F-box蛋白，在線蟲(chóng)侵染后的3dpi、7dpi、15dpi及25dpi均上升表達(dá)。因此ORF905及ORF908也篩選為Hs1-2位點(diǎn)的抗病候選基因。通過(guò)甜菜發(fā)根體系，應(yīng)用RNAi方法對(duì)ORF902及ORF904的功能進(jìn)行了分析，結(jié)果當(dāng)靶標(biāo)基因沉默后，植物的抗病表型并