兩個油菜NAC基因的鑒定及其表達和功能的初步研究.pdf

1、油菜（Brassica napus）屬于十字花科，是一種重要的油料作物。油菜籽是我國對外貿易中的大型農產品之一。因此，研究油菜在脅迫環(huán)境中的表達情況及分子調控機制，對于提高油菜產量具有十分重要意義。NAC轉錄因子是近十幾年來發(fā)現(xiàn)的一類植物特有的轉錄因子，迄今為止，在其他真核生物中還未發(fā)現(xiàn)同源物，其主要特征是含有一個十分保守的DNA結合部位的N端部分和一個高度變異且具有轉錄激活功能的C端部分。N端部分又可以劃分為五個子結構域(A，B，C，

2、D，E)，其中A、C、D高度保守，B和E保守性不強。NAC轉錄因子不僅在植物生長發(fā)育和器官建成過程中有重要的影響，而且在激素調節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。本文從油菜中克隆鑒定了兩個NAC基因，分別命名為BnNAC2和BnNAC5，并對這兩個基因的表達及功能進行了研究探討，取得如下主要結果：
　　 1.油菜BnNAC2和BnNACS基因在NaCl，Mannitol，ABA脅迫處理下的誘導表達
　　

3、 為了研究油菜中的NAC基因，我們通過生物信息學的方法，找到了六個油菜的NAC基因，并命名為BnNACl-6。首先通過實時定量RT-PCR分析了這六個基因在鹽脅迫、干旱，ABA脅迫下的表達模式，結果表明，BnNAC2和BnNAC5這兩個基因在一定時間范圍內的表達受到鹽，甘露醇（模擬干旱）以及ABA的誘導較顯著。這些結果說明BnNAC2和BnNAC5可能參與植物體對鹽、干旱和ABA的脅迫應答，同時也間接說明干旱和高鹽脅迫信號以及干旱與AB

4、A信號通路之間可能存在著交叉。
　　 2.油菜BnNAC2和BnNAC5基因的分離鑒定
　　 從油菜cDNA中分離克隆了這兩個2個油菜NAC基因：BnNAC2和BnNAC5。其后，用PCR的方法從油菜基因組中分離了BnNAC2和BnNAC5基因的DNA全長序列，通過全長分析發(fā)現(xiàn)均含有3個外顯子和2個內含子。對同類NAC蛋白的比較分析表明，BnNAC2/5基因的編碼蛋白的N端非常保守，并可以分為五個亞結構域，而C端則表現(xiàn)為

5、高度多樣性。
　　 3.油菜BnNAC2和BnNAC5基因在不同組織中的表達模式
　　 提取油菜不同組織的總RNA，逆轉錄成cDNA。利用實時定量RT-PCR技術分別對BnNAC2和BnNAC5基因的表達情況進行分析，結果顯示BnNAC2/5在各個組織中均有表達，BnNAC2在花組織中表達量最高，BnNAC5在莖中表達量最高。同時我們分離了BnNAC2基因的啟動子，構建了BnNAC2promoter::GUS融合表達載體

6、，采用農桿菌介導的方法轉化擬南芥，利用GUS組織化學分析技術研究BnNAC2啟動子在轉基因擬南芥中的活性，發(fā)現(xiàn)其表達模式與RT-PCR結果一致?？偟膩碚f，以上結果表明這兩個基因可能在油菜的不同組織器官發(fā)育中發(fā)揮作用。
　　 4.油菜BnNAC2和BnNAC5蛋白的轉錄激活分析
　　 將油菜BnNAC2和BnNAC5基因構建到PGBKT7載體中，分別轉化酵母菌株AH109和Y187，分析其轉錄自激活活性。結果表明，BnNA

7、C2蛋白具有轉錄激活功能，而BnNAC5不具備轉錄激活功能，推測BnNAC5可能在細胞內發(fā)揮轉錄抑制作用。
　　 5.在轉裂殖酵母中過量表達BnNAC2和BnNACS基因增強了細胞對鹽和干旱的敏感性
　　 將BnNAC2和BnNAC5基因構建在PREP5N載體上，導入裂殖酵母，進行這兩個基因的過量表達分析。通過在不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉化細胞，觀察其生長狀態(tài)，結果表明，誘導BnNAC2和BnNAC5基因的表達將會導致酵母細胞