紅掌再生體系建立及轉(zhuǎn)CmDREB基因研究.pdf

1、紅掌(Anthurium andraeanum)是觀賞價值很高的溫室花卉，在花卉商業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。紅掌夜間生長適溫為18-20℃，白天為25℃左右。在夏季，若夜間室溫度超過25℃或白天室內(nèi)溫度超過30℃時，或在冬季，若夜間室溫度低于12℃或白天室溫低于18℃時，其生長受到嚴重影響，觀賞價值也隨之下降。為此，在夏季期必須采取人為降溫措施，而在冬季則必須人為進行加溫，使得室內(nèi)溫度適宜紅掌的生長。然而，降溫和加溫措施都顯著地增加了紅掌生

2、產(chǎn)成本。因此，篩選、培育耐高溫和低溫的紅掌新品種對于降低生產(chǎn)成本具有有巨大的經(jīng)濟價值。近年來，通過導(dǎo)入DREB基因，從而改良作物的抗逆性，已經(jīng)在許多農(nóng)作物中獲得成功，但利用DREB基因轉(zhuǎn)紅掌的研究還未見報道。為此，本文對紅掌高效再生體系進行了研究，在此基礎(chǔ)上開展了紅掌‘Sonate’品種的轉(zhuǎn)CmDREB的基因研究。具體研究結(jié)果如下:
　　 1.紅掌高效再生體系的建立
　　 以9個紅掌品種的葉片為外植體，構(gòu)建起再生體系，比

3、較不同品種的葉片再生能力。結(jié)果表明，只有4個品種能產(chǎn)生愈傷組織。在75％乙醇消毒30 s和0.1％升汞消毒5 min的條件下，這4個品種外植體污染率為0。暗培養(yǎng)可有效抑制紅掌誘導(dǎo)愈傷組織褐化，在改良1/2 MS(NH4NO3的含量降低到1/4)+1 mg/L6-BA+0.1 mg/L2.4-D+100 mg/LVc對紅掌誘導(dǎo)愈傷組織較好。
　　 此外，以紅掌品種‘Sonate’無菌組培苗的葉片、葉柄和莖段為外植體，研究了不同外植

4、體的愈傷組織再生和分化過程，并對誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行篩選。結(jié)果表明莖段作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織效果最好;最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基是1/2MS+1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LIBA，再生率90％;最佳生根培養(yǎng)基是1/2MS+0.5 mg/L IBA，生根率96.2％。
　　 2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
　　 以紅掌品種‘Sonate’試管苗的愈傷塊為試材，對預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染時間、共培養(yǎng)時間、延遲培養(yǎng)時間、誘導(dǎo)物、篩

5、選方式、抑菌方法等與遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)的參數(shù)進行了研究，建立的最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系為:以無菌苗愈傷快作為轉(zhuǎn)化受體，預(yù)培養(yǎng)7d，菌液OD600為0.4時侵染10 min，25℃黑暗條件共培養(yǎng)3d，延遲培養(yǎng)5d。利用此體系進行了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。另外，在共培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物乙酰丁香酮(Acs)能抑制愈傷褐化，有利于轉(zhuǎn)化。紅掌愈傷塊對潮霉素十分敏感，濃度為8 mg/L時就部褐化，因此本試驗中確定葉盤分化選擇壓為5～8 mg/L，幼苗生根選擇壓為6 mg/L。

6、抑菌抗生素（頭孢霉素）對紅掌愈傷塊再生具有強烈抑制作用，500 mg/L頭孢霉素在有效抑制根癌農(nóng)桿菌生長的同時也抑制了不定芽的再生，降低到400 mg/L時可獲75％的再生率，但抑菌效果不顯著，采用逐步降低抑菌素濃度的方法，即在延遲培養(yǎng)階段使用500 mg/L徹底脫菌，之后降為400mg/L、300mg/L、200mg/L抑制農(nóng)桿菌滋生取得了較好效果，有效地提高了轉(zhuǎn)化效率。
　　 3.紅掌抗性芽的篩選、植株再生和檢測
　　

7、 抗性芽篩選過程中，首先選用延遲篩選的方法將受侵染愈傷塊置于1/2 MS+1.0mg/L6-BA+1.0 mg/LIBA+500 mg/LCef+100μmol/LAcs培養(yǎng)基上延遲培養(yǎng)5d，之后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基1/2 MS+1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L IBA+400 mg/LCef+100μmol/LAcs培養(yǎng)至誘導(dǎo)出抗性芽，然后將塊轉(zhuǎn)入1/2 MS+1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L IBA+5mg/L Hy

8、g+300 mg/L Cef+100μmol/L Acs培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，到抗性芽生長到1 cm，切取帶有抗性芽點的愈傷塊轉(zhuǎn)入零選擇壓的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1/2 MS+1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L IBA使抗性芽恢復(fù)生長，待不定芽長到3 cm左右時，切取不定芽轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基1/2 MS+0.1 mg/L IBA+6 mg/L Hyg進行生根篩選。將生根篩選獲得的部分抗性單株（54株）進行潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPT)的PCR