三種楊樹再生體系的建立及三倍體銀中楊轉(zhuǎn)YUCCA1基因的研究.pdf

1、楊樹是楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)植物的統(tǒng)稱，具有早期速生、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣、種類和品種多、容易雜交、容易改良遺傳性、容易無(wú)性繁殖等特點(diǎn)，廣泛用于生態(tài)防護(hù)林、三北防護(hù)林、農(nóng)林防護(hù)林和工業(yè)用材林，同時(shí)也是道路綠化、園林景觀的優(yōu)秀樹種。而且，楊樹作為速生樹種之一，世界范圍內(nèi)栽培廣泛，遺傳資源豐富，無(wú)性再生能力強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，輪伐周期相對(duì)較短，被普遍認(rèn)為是未來(lái)生物能源的重要物種之一。但是依靠常規(guī)育種方法，育種周期長(zhǎng)，工序

2、復(fù)雜，且受氣候、地域和水分等的影響，選育新品種難度大，難以滿足有目的定向培育楊樹新品種的需要。自80年代以后，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是基因工程技術(shù)的發(fā)展給楊樹育種帶來(lái)了前所未有的變革，極大地提高了育種效率和擴(kuò)展了育種目標(biāo)。至今為止，楊樹轉(zhuǎn)基因育種工作已開展二十多年，雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)已日漸成熟，但仍存在缺乏轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)及轉(zhuǎn)化率低等問題。因此，建立高效穩(wěn)定的楊樹離體再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，可為進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種和基因功能快速驗(yàn)證提供技術(shù)平

3、臺(tái)，具有重要的科學(xué)意義。
　　 本研究以三倍體銀中楊(Triploid Populus alba×P.berolinensis)、中林46楊(P.deltoides Cl.‘Zhonglin46’)、西豐楊25號(hào)(P.deltoldes Bartr.×P.cathayana Rehd.Cl.'Xifeng-25')三個(gè)楊樹品種為試驗(yàn)材料，通過對(duì)不同培養(yǎng)階段最佳培養(yǎng)基的篩選，建立了其穩(wěn)定高效的再生體系，并在此基礎(chǔ)上，以三倍體銀中楊

4、試管苗葉片為受體材料，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化YUCCA1基因，對(duì)影響三倍體銀中楊轉(zhuǎn)化效率的主要因素進(jìn)行了研究，研究結(jié)果如下：
　　 1、三種楊樹高效再生體系的建立：以三倍體銀中楊、中林46楊和西豐楊25號(hào)帶芽莖段為外植體，通過一系列試驗(yàn)，建立了三種楊樹的高效再生系統(tǒng)，篩選出三種楊樹不同階段最佳培養(yǎng)基與激素濃度分別為：
　　 (1)三倍體銀中楊：①初代培養(yǎng)：1/2MS+TDZ0.02 mg·L-1(單位下同)+NAA0.

5、05，10 d后腋芽萌發(fā)，30 d后腋芽萌發(fā)率可達(dá)96％，芽平均長(zhǎng)度為6.0 cm；②繼代培養(yǎng)：MS+BA0.05+NAA0.02，30 d后分化率可達(dá)100％，莖高為3.5 cm，60 d后莖高達(dá)7.0 cm；③生根培養(yǎng)：1/2MS+NAA0.05+IBA0.20，20 d后生根率可達(dá)100％。
　　 (2)中林46楊：①初代培養(yǎng)：1/2MS+BA7.5+NAA0.05+TDZ0.02，10 d后腋芽萌發(fā)，30 d后腋芽的萌發(fā)

6、率為88％，芽平均長(zhǎng)度為4.0 cm；②繼代增殖培養(yǎng)：MS+BA0.5+NAA0.05+IBA0.1，30 d后分化率可達(dá)92％，平均不定芽數(shù)10.2個(gè)；③壯苗培養(yǎng)：MS+BA0.1+IBA0.3，30 d后莖高3.5 cm，壯苗率為90％；④生根培養(yǎng)：1/2MS+NAA0.01+IBA0.3，20 d后生根率可達(dá)93％;
　　 (3)西豐楊25號(hào)：①初代培養(yǎng)：1/2MS+TDZ0.02+NAA0.05，10 d后腋芽萌發(fā)，30

7、 d后腋芽的萌發(fā)率為94％，芽平均長(zhǎng)度為5.0 cm；②繼代增殖培養(yǎng)：MS+TDZ0.02+NAA0.05，30 d后分化率可達(dá)96％，平均不定芽數(shù)12.1個(gè)；③壯苗培養(yǎng)：MS+BA0.02+NAA0.02，30 d后莖高5.0 cm，壯苗率為92％；④生根培養(yǎng)：1/2MS+NAA0.02+IBA0.3，20 d后生根率為90％。
　　 上述培養(yǎng)基均添加25 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，pH值為5.8，培養(yǎng)溫度(25±2

8、)℃，光照度2000 lx，光照時(shí)間12-14 h·d-1。
　　 2、三倍體銀中楊遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立：以三倍體銀中楊試管苗葉片為外植體，建立了葉片不定芽再生體系，并在此基礎(chǔ)上，確定了不定芽再生和生根的卡那霉素(Km)選擇壓及抑菌抗生素濃度。結(jié)果表明，三倍體銀中楊最佳葉片不定芽再生培養(yǎng)基為1/2MS+BA0.6+NAA0.1+25 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，不定芽再生率達(dá)99.4％，每葉平均生芽數(shù)約10.1個(gè)；葉片

9、不定芽再生和生根的Km選擇壓均為50 mg·L-1；mg·L-1，且不會(huì)影響葉片不定芽的再生及生根。
　　 3、三倍體銀中楊遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化：以銀中楊試管苗葉片為受體材料，研究了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮濃度、選擇方式6個(gè)因素對(duì)三倍體銀中楊遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果顯示三倍體銀中楊最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為：葉片預(yù)培養(yǎng)2 d，OD600nm=0.6的菌液侵染20 min，共培養(yǎng)4 d，共培養(yǎng)基中

10、添加乙酰丁香酮50μmol·L-1，共培養(yǎng)后延遲14 d選擇。經(jīng)過不定芽再生選擇培養(yǎng)和不定芽生根選擇培養(yǎng)，共獲得62株Km抗性植株。
　　 4、Km抗性植株的PCR檢測(cè)：將獲得的62株Km抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示有16株呈陽(yáng)性反應(yīng)，初步證明YUCCA1基因已被導(dǎo)入到三倍體銀中楊基因組中。
　　 綜上所述，本研究以三倍體銀中楊、中林46楊和西豐楊25號(hào)為試驗(yàn)材料，在建立其穩(wěn)定高效再生體系的基礎(chǔ)上，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)