棕色棉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及GhANR功能初步研究.pdf

1、本研究以新疆自育棕色棉品種新彩棉5號(hào)和新彩棉13號(hào)為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)莖尖轉(zhuǎn)化法和基因槍轟擊莖尖法，建立了棕色棉莖尖農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系和莖尖基因槍遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。采用以上兩種轉(zhuǎn)化方法，成功將GhANR基因?qū)氲阶厣奁贩N中，經(jīng)卡那霉素抗性莖尖篩選、抗性芽誘導(dǎo)生根、PCR和qPCR分子檢測(cè)，獲得了新彩棉5號(hào)和13號(hào)陽性轉(zhuǎn)基因植株，并得到了T2代轉(zhuǎn)基因種子，為新疆棕色棉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：1.棕色

2、棉農(nóng)桿菌介導(dǎo)莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的最佳轉(zhuǎn)化條件是：暗培養(yǎng)4d、光照培養(yǎng)2d的無菌苗莖尖，農(nóng)桿菌菌液 OD600值為0.6～0.8之間，侵染時(shí)間10min，共培養(yǎng)48h，然后在 MSB+8g·L－1瓊脂+100/125mg·L－1卡那霉素篩選培養(yǎng)基中篩選25d，再將抗性芽轉(zhuǎn)繼于1/2MS+1g·L-1活性炭的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)抗性芽生根，獲得抗性再生植株。通過PCR檢測(cè)，1250個(gè)新彩棉5號(hào)莖尖獲得5株陽

3、性轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為0.4％，1200個(gè)新彩棉13號(hào)莖尖獲得3株陽性轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為0.25%。
　　2.棕色棉莖尖基因槍遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
　　最佳的莖尖基因槍遺傳轉(zhuǎn)化體系為：暗培養(yǎng)4d，光照培養(yǎng)1d的無菌苗莖尖，前滲處理4h；金粉微載體直徑為1μm，質(zhì)粒濃度為1.0μg·μL－1，轟擊壓力為7.586MPa（1100 psi），轟擊距離為9cm，真空度為0.0946MPa(28 inch Hg)時(shí)進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化，轟擊

4、后恢復(fù)培養(yǎng)4d。然后在MSB+8g·L－1瓊脂+125mg·L－1卡那霉素篩選培養(yǎng)基中篩選25d。獲得抗性芽后，在1/2MS+1g·L-1活性炭的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)抗性芽生根，獲得抗性再生植株。通過PCR檢測(cè)，5200個(gè)新彩棉5號(hào)莖尖共獲得16株陽性轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為0.31%。
　　3. GhANR基因的功能初步分析
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)莖尖轉(zhuǎn)化法和基因槍轟擊法獲得新彩棉5號(hào)轉(zhuǎn)基因株系12個(gè)和新彩棉13號(hào)轉(zhuǎn)基因株系2個(gè)。qP