高賴氨酸轉(zhuǎn)基因水稻的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)及代謝關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、稻米富含淀粉和優(yōu)質(zhì)蛋白，是人類主要的能量與蛋白來源。但稻米中缺乏賴氨酸，被稱為第一限制性必需氨基酸，影響稻米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。植物中賴氨酸的代謝調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，其積累不僅受本身反饋抑制，還與降解代謝有關(guān)，而且與其它眾多代謝通路相關(guān)聯(lián)。其中天冬氨酸激酶(AK)和二氫吡啶二羧酸合酶(DHPS)是賴氨酸合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶，賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶(LKR/SDH)是其降解途徑中最重要的酶。在前期研究中，為通過基因工程技術(shù)調(diào)控水稻胚

2、乳中賴氨酸的代謝，創(chuàng)新高賴氨酸水稻種質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)室培育了大量的轉(zhuǎn)基因水稻材料，包括在水稻中過表達(dá)對(duì)賴氨酸反饋抑制不敏感的大腸桿菌AK和DHPS基因、抑制水稻內(nèi)源LKR/SDH基因表達(dá)、同時(shí)過表達(dá)AK和DHPS基因及抑制LKR/SDH表達(dá)等。不同轉(zhuǎn)基因水稻事件中對(duì)于賴氨酸含量的提高幅度存在明顯差異。此外，對(duì)于賴氨酸含量稻米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、田間表型以及代謝關(guān)聯(lián)效應(yīng)等也不十分明了。
　　本研究重點(diǎn)以粳稻品種武香粳9號(hào)及其來源的5個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻新

3、品系為材料，從分子鑒定、品質(zhì)分析、田間表現(xiàn)、營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)、代謝組與轉(zhuǎn)錄組比較、以及代謝關(guān)聯(lián)等多個(gè)方面開展了研究，以期進(jìn)一步對(duì)高賴氨酸轉(zhuǎn)基因水稻開展系統(tǒng)的評(píng)價(jià)分析，并為優(yōu)化代謝調(diào)控途徑以培育營(yíng)養(yǎng)改良型作物提供依據(jù)。所用的5個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻分別為:(1)35S-15轉(zhuǎn)基因系，含有由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的大腸桿菌AK和DHPS基因（簡(jiǎn)稱為35S轉(zhuǎn)基因事件）;(2) GR-14和GR-65轉(zhuǎn)基因系，含有分別由水稻谷蛋白基因GluB-1和Gt1啟動(dòng)子

4、（胚乳特異性表達(dá)）驅(qū)動(dòng)的大腸桿菌AK和DHPS基因、以及由水稻Gt1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的水稻LKR基因的RNAi結(jié)構(gòu)（簡(jiǎn)稱為GR轉(zhuǎn)基因事件）;(3) HFL1和HFL2轉(zhuǎn)基因系，由GR-14或GR-65分別與35S-15雜交并經(jīng)自交產(chǎn)生的聚合轉(zhuǎn)基因系，均聚合有35S和GR兩類轉(zhuǎn)基因事件。所有轉(zhuǎn)基因水稻中都已去除了抗生素選擇標(biāo)記基因。開展的研究工作及取得的主要研究結(jié)果如下。
　　1、高賴氨酸轉(zhuǎn)基因水稻的分子鑒定、品質(zhì)分析與田間表現(xiàn)
　

5、　從分子特征、理化與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、田間表現(xiàn)等方面對(duì)5份轉(zhuǎn)基因水稻新品系及其未轉(zhuǎn)化對(duì)照(WT)進(jìn)行了較為詳細(xì)的比較分析，特別在2個(gè)聚合轉(zhuǎn)基因系（HFL1和HFL2）與其雙親（35S和GR）間的效應(yīng)作了系統(tǒng)比較。定量RT-PCR和Western blot分析顯示，轉(zhuǎn)基因水稻中外源AK和DHPS基因能高效表達(dá)，水稻內(nèi)源LKR基因的表達(dá)則被有效抑制，但對(duì)水稻內(nèi)源AK和DHPS基因的表達(dá)并未產(chǎn)生顯著影響。氨基酸測(cè)定結(jié)果表明，在35S-15轉(zhuǎn)基因水稻成

6、熟籽粒中游離賴氨酸含量與野生型WT相比提高較少，只提升了35％;在GR-14和GR-65轉(zhuǎn)基因成熟籽粒中游離賴氨酸含量顯著提高，與WT相比分別提高了10倍和8倍;可喜的是，在聚合轉(zhuǎn)基因系HFL1和HFL2成熟籽粒中游離賴氨酸含量進(jìn)一步提高，與親本W(wǎng)T相比分別提高了25倍和20倍。在游離賴氨酸提高的同時(shí)，HFL1和HFL2轉(zhuǎn)基因成熟種子中的總游離氨基酸含量、總賴氨酸含量和總氨基酸含量也顯著增加，蛋白質(zhì)含量也有所提高。說明，聚合35S和GR

7、兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，可進(jìn)一步促進(jìn)賴氨酸在水稻籽粒中的累積。
　　對(duì)稻米主要理化品質(zhì)性狀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示含有較高賴氨酸的聚合轉(zhuǎn)基因系HFL1和HFL2種子中的直鏈淀粉含量略有下降、膠稠度趨軟，但對(duì)淀粉品質(zhì)并未產(chǎn)生顯著的影響。田間試驗(yàn)表明，除35S-15的株高稍低于野生型WT外，各轉(zhuǎn)基因水稻的主要農(nóng)藝性狀與WT相比并無(wú)顯著差異，產(chǎn)量也與WT相當(dāng)。但隨著賴氨酸在水稻籽粒中富集，兩個(gè)HFL轉(zhuǎn)基因水稻的部分籽粒呈現(xiàn)棕褐色表型。種子萌發(fā)試驗(yàn)顯示

8、，高賴氨酸轉(zhuǎn)基因成熟種子萌發(fā)勢(shì)要稍快于野生型，這完全不同于擬南芥和煙草等雙子葉植物。在種子萌發(fā)早期高賴氨酸種子中淀粉水解速度要快于親本對(duì)照，相應(yīng)的淀粉酶活性也增強(qiáng);但隨著種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建，后期轉(zhuǎn)基因水稻種子中淀粉水解、還原性糖積累以及相關(guān)水解酶活性與WT相比并沒有顯著的差異。
　　2、高賴氨酸轉(zhuǎn)基因稻米的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)
　　為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)在水稻籽粒中提高賴氨酸含量后的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，本研究以上述培育的2個(gè)聚合轉(zhuǎn)基因系HFL1和HFL

9、2及其未轉(zhuǎn)化親本W(wǎng)T大米為材料配制飼料，通過60天飼喂SD大鼠試驗(yàn)進(jìn)行分析評(píng)估。在試驗(yàn)中還設(shè)置了野生型WT稻米添加不同劑量合成賴氨酸的飼料，用以比較并驗(yàn)證添加外源賴氨酸對(duì)提高稻米營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的作用。添加外源賴氨酸的劑量分別為在WT稻米原賴氨酸含量的基礎(chǔ)上提高10％、20％、40％和60％，飼喂的4組SD鼠分別稱為WT+10％Lys組、WT+20％Lys組、WT+40％Lys組和WT+60％Lys組。
　　在60天喂養(yǎng)試驗(yàn)中，各組大鼠均

10、表現(xiàn)正常，生命力活躍，無(wú)非正常死亡現(xiàn)象。食用含高賴氨酸轉(zhuǎn)基因稻米的HFL1組和HFL2組SD大鼠在體重增長(zhǎng)、食物利用率等生物性能上均顯著優(yōu)于食用含非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾竺椎腤T組，與添加相似賴氨酸劑量的WT+20％Lys組相當(dāng)。氮平衡試驗(yàn)結(jié)果顯示，食用高賴氨酸轉(zhuǎn)基因稻米的SD大鼠組的食物表觀消化率、蛋白質(zhì)功效比和賴氨酸利用效率都顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誛T組，而與WT+20％Lys組相似。由此表明，轉(zhuǎn)基因稻米中提高賴氨酸含量可顯著提升其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且

11、與外添相同劑量的野生型WT+20％Lys組具有相同的效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)還表明，在大米中添加賴氨酸的劑量并不是越多越好，以添加20-40％的劑量對(duì)提升稻米營(yíng)養(yǎng)效率最為合適。此外，與非轉(zhuǎn)基因WT組相比，食用轉(zhuǎn)基因稻米組SD鼠的心、肝、脾等臟器重與體重的比值（臟體比）并未出現(xiàn)明顯的差異，初步說明食用高賴氨酸轉(zhuǎn)基因稻米并未對(duì)大鼠產(chǎn)生其它不良效應(yīng)。
　　3、高賴氨酸轉(zhuǎn)基因水稻的代謝組與轉(zhuǎn)錄組分析
　　植物中賴氨酸代謝與其它多個(gè)代謝途徑

12、相關(guān)聯(lián)。根據(jù)上述研究，在轉(zhuǎn)基因水稻中累積賴氨酸后會(huì)產(chǎn)生籽粒色澤變化等非預(yù)期效應(yīng)。為此，本研究借助整合了正離子LC-MS/MS（液-質(zhì)聯(lián)用）、負(fù)離子LC-MS/MS和GC-MS（氣-質(zhì)聯(lián)用）三種分析模式的高通量代謝分析技術(shù)，對(duì)上述5份不同轉(zhuǎn)基因水稻葉片、發(fā)育籽粒及成熟種子的代謝譜進(jìn)行分析;同時(shí)，通過RNA-Seq技術(shù)對(duì)葉片和發(fā)育籽粒中的轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行比較分析，以期從物質(zhì)代謝和分子水平進(jìn)一步了解轉(zhuǎn)基因調(diào)控賴氨酸代謝后可能的關(guān)聯(lián)效應(yīng)。
　　

13、對(duì)代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析顯示，轉(zhuǎn)基因調(diào)控賴氨酸代謝關(guān)鍵酶表達(dá)對(duì)抽穗期葉片和發(fā)育籽粒中代謝物質(zhì)種類與含量的影響極小，但不同轉(zhuǎn)基因事件的效應(yīng)有所差異。在由胚乳特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GR轉(zhuǎn)基因系中，與親本對(duì)照WT相比僅有1-2種差異代謝物質(zhì)(p＜0.05);在組成型表達(dá)外源AK和DHPS基因的35S-15轉(zhuǎn)基因葉片和發(fā)育籽粒中，差異代謝物的數(shù)量較GR中的稍多。在轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子中，與親本對(duì)照WT相比有顯著含量差異(p＜0.05)的代謝物數(shù)量較多，尤

14、其是賴氨酸積累多的聚合轉(zhuǎn)基因系HFL1和HFL2。這些差異代謝物質(zhì)主要為氨基酸類，其次是多肽類、脂類、核苷酸類、碳水化合物等。
　　取各轉(zhuǎn)基因水稻開花后10天或15天發(fā)育籽粒，對(duì)其總RNA進(jìn)行RNA-Seq分析。結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)化對(duì)照WT相比，GR-65和HFL2兩個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻中差異表達(dá)基因數(shù)量較多，而35S-15、GR-14和HFL1三個(gè)轉(zhuǎn)基因系中的差異表達(dá)基因相對(duì)較少，這可能是由于GR-65與GR-14不同獨(dú)立轉(zhuǎn)基因事件間差異

15、引起的。通過GO富集和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)雖然不同轉(zhuǎn)基因事件間差異表達(dá)基因數(shù)量不同，但這些差異表達(dá)基因主要在細(xì)胞代謝過程、初級(jí)代謝過程、生物合成和小分子代謝過程等活動(dòng)中顯著富集。以KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)作為參考，將差異表達(dá)基因歸入到不同的代謝通路中，顯示它們主要集中在氨基酸代謝、植物脅迫響應(yīng)、脂類代謝、碳水化合物代謝等途徑中。此外，分析結(jié)果還顯示轉(zhuǎn)基因水稻花后15天發(fā)育籽粒中差異表達(dá)基因的數(shù)量要明顯少于花后10天發(fā)育籽粒;而灌漿后期種子中的差

16、異表達(dá)基因多數(shù)與脅迫響應(yīng)有關(guān)。說明來自于天冬氨酸家族通路的賴氨酸代謝通路與多種代謝通路相關(guān)聯(lián)，在植物代謝中具有多重角色。
　　4、高賴氨酸轉(zhuǎn)基因水稻褐色籽粒形成的代謝關(guān)聯(lián)解析
　　在賴氨酸富集的兩個(gè)HFL轉(zhuǎn)基因水稻籽粒中往往會(huì)出現(xiàn)棕褐色的表型。為深入探析其形成的原因，本研究對(duì)相關(guān)的代謝物及其關(guān)聯(lián)途徑進(jìn)行詳細(xì)的分析與驗(yàn)證。對(duì)不同發(fā)育時(shí)期籽粒中賴氨酸含量及籽粒色澤進(jìn)行分析，表明褐色表型與賴氨酸的積累高度相關(guān)。綜合代謝組和轉(zhuǎn)錄組的

17、數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在含有棕褐色表型的種子中，賴氨酸代謝、TCA循環(huán)和糖酵解、芳香族氨基酸及相關(guān)次生代謝、糖水化合物代謝、嘌呤和嘧啶代謝、以及脂類代謝等通路上發(fā)生或多或少的更改。結(jié)果顯示，棕褐色種子中特異性地積累了5-羥色胺和色胺等色氨酸代謝途徑中的相關(guān)代謝物。從轉(zhuǎn)基因水稻HFL籽粒中提取褐色物質(zhì)進(jìn)行HPLC-MS分析，發(fā)現(xiàn)其中含有大量的色胺和5一羥色胺;RT-PCR分析也證實(shí)色氨酸代謝相關(guān)基因TDC（編碼色氨酸脫羧酶）和T5H（編碼5-羥色

18、胺合酶）表達(dá)顯著上調(diào)。為進(jìn)一步證實(shí)褐色物質(zhì)是否是由5-羥色胺等引起的，在轉(zhuǎn)基因水稻中過表達(dá)TDC1和TDC3基因，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因的愈傷組織及種子中都有大量色胺和5-羥色胺積累，并同樣可以引起褐色表型。由此說明，高賴氨轉(zhuǎn)基因水稻種子的褐色成分主要是由5-羥色胺和色胺等引起的。
　　在高等植物中，色氨酸與賴氨酸兩個(gè)代謝通路間相距較遠(yuǎn)，其間的關(guān)聯(lián)還不清楚。為此，經(jīng)對(duì)含褐色成分的種子與正常色澤種子等進(jìn)進(jìn)代謝譜的特異性比較、并結(jié)合轉(zhuǎn)錄譜比較，

19、顯示茉莉酸等大量與植物脅迫響應(yīng)有關(guān)的代謝物及其基因表達(dá)水平增加，推測(cè)在高賴氨酸轉(zhuǎn)基因水稻中由于賴氨酸累積，增強(qiáng)了茉莉酸途徑并誘導(dǎo)了TDC等基因的表因，從而造成5-羥色胺和色胺的積累。進(jìn)一步用定量RT-PCR等進(jìn)一步證實(shí)了上述推測(cè)。此外，又通過在灌漿期設(shè)置不同溫度處理，顯示棕褐色表型受低溫誘導(dǎo)，高溫條件下充實(shí)的種子中幾乎沒有棕褐色表型。綜合上述分析，推斷調(diào)控賴氨酸代謝通路使籽粒中賴氨酸有效累積，從而提高了植物脅迫響應(yīng)相關(guān)途徑的活性，進(jìn)而誘