高賴氨酸轉(zhuǎn)基因玉米植株的再生與檢測(cè).pdf

1、玉米是我國(guó)第一大作物，不僅是重要的糧食來(lái)源，而且還是重要的飼料、工業(yè)原料。統(tǒng)計(jì)表明，我國(guó)80%以上的玉米主要用作飼料，但是由于普通玉米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)較差，缺乏人體及單胃動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育必需的賴氨酸，色氨酸等，在作為飼料時(shí)必須添加賴氨酸等物質(zhì)才能滿足畜禽生長(zhǎng)發(fā)育的需要，因此，發(fā)展高賴氨酸優(yōu)質(zhì)功能型玉米不僅可以促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)和相關(guān)飼料加工業(yè)的快速發(fā)展，而且對(duì)解決我國(guó)部分人群的營(yíng)養(yǎng)不良問(wèn)題也具有重要的意義。
　　 對(duì)opaque-2基因的成功

2、利用大大加速了優(yōu)質(zhì)蛋白玉米育種的進(jìn)程，但是其隱性遺傳和影響胚乳硬度的特點(diǎn)嚴(yán)重影響了育種效率。在這種情況下，通過(guò)基因工程技術(shù)降低或沉默玉米籽粒胚乳中醇溶蛋白基因家族的表達(dá)，以此提高其他富含賴氨酸蛋白質(zhì)含量從而達(dá)到提高玉米胚乳中總賴氨酸含量的目的已經(jīng)得到證實(shí)。因此我們?cè)谇叭说难芯炕A(chǔ)上，構(gòu)建了玉米22-KD醇溶蛋白基因干涉載體，采用基因槍轟擊的方法轉(zhuǎn)化玉米幼胚愈傷組織，取得如下進(jìn)展：
　　 1、將含有玉米醇溶蛋白基因目標(biāo)序列的干涉基

3、因(22-KD)與Bar基因按3：1的比例混合，通過(guò)基因槍轟擊玉米H99×HiB F1代胚性愈傷組織，每個(gè)干涉基因構(gòu)建的載體轟擊200槍?zhuān)只着邤?shù)為3356個(gè)。通過(guò)bar基因的抗性篩選，得到90個(gè)分化幼苗，T0代PCR檢測(cè)得到的陽(yáng)性獨(dú)立事件數(shù)為60個(gè)，但由于轉(zhuǎn)基因植株生活力較差，最終可以正常生長(zhǎng)收獲的轉(zhuǎn)基因事件數(shù)為9個(gè)。
　　 2、通過(guò)PCR跟蹤鑒定，T1代22-KD獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株44株。
　　 3、近紅外谷物品質(zhì)

4、分析儀對(duì)22-KD T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的籽粒進(jìn)行賴氨酸含量檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)22-KD干涉基因的陽(yáng)性株系中有3個(gè)株系賴氨酸含量低于對(duì)照，4個(gè)株系的賴氨酸含量提高了5.2%-23.4%，2個(gè)株系的賴氨酸含量達(dá)到了優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的標(biāo)準(zhǔn)(0.419和0.468)，分別比對(duì)照提高了46.5%和63.6%。
　　 4、利用SAS-PAGE蛋白質(zhì)電泳對(duì)22-KD T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的籽粒進(jìn)行醇溶蛋白檢測(cè)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)22-KD干涉基因的陽(yáng)性