12701.轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)的內(nèi)參基因篩選與鑒定

1、I摘要內(nèi)參基因是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)識(shí)制度中所必需的檢測(cè)參照基因。在檢測(cè)系統(tǒng)中，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)待檢測(cè)樣品的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將被轉(zhuǎn)入基因作為檢測(cè)的對(duì)象，利用內(nèi)參基因作物對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果能夠效地鑒定待檢測(cè)材料物種來(lái)源以及PCR檢測(cè)系統(tǒng)工作正常與否；通過(guò)和轉(zhuǎn)入基因的相對(duì)定量結(jié)果比較，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)樣品中轉(zhuǎn)入基因的基因組水平定量分析。目前，對(duì)于已商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物品種如大豆、番茄均已開(kāi)發(fā)出了相應(yīng)的內(nèi)參基因，針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的內(nèi)參基因開(kāi)發(fā)尚處于起步階段

2、。本研究首先利用BLAST和BLINK序列比對(duì)篩選得到轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)內(nèi)參基因的候選基因。然后從種內(nèi)非特異性、種間特異性、拷貝數(shù)恒定等方面進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選，經(jīng)過(guò)非玉米物種和不同的玉米自交系品種中的物種特異性、種內(nèi)非特異性檢測(cè)，拷貝數(shù)分析，獲得了如下主要結(jié)果：1.利用PIGD、NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)信息，通過(guò)BLAST和BLINK序列比對(duì)，確定了20個(gè)玉米特異無(wú)內(nèi)含子基因作為玉米內(nèi)參基因的候選基因；2.設(shè)計(jì)出玉米基因組DNA為模板的特異性擴(kuò)增

3、引物，以20個(gè)候選內(nèi)參基因的外顯子為篩選區(qū)域，限制最短片段長(zhǎng)度為200bp。通過(guò)對(duì)以上基因的逐條信息檢索，設(shè)計(jì)引物，PCR驗(yàn)證，最終選用以玉米GRMZM2G054655作為最優(yōu)玉米轉(zhuǎn)基因檢測(cè)內(nèi)參基因；3.根據(jù)篩選獲得的玉米轉(zhuǎn)基因檢測(cè)內(nèi)參基因GRMZM2G054655序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，通過(guò)普通PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該基因具有較高種內(nèi)穩(wěn)定性和種間特異性；4.通過(guò)對(duì)玉米轉(zhuǎn)基因檢測(cè)內(nèi)參基因定量檢測(cè)條件的優(yōu)化，建立了穩(wěn)定高效，重復(fù)性較好的玉米