甘蔗內(nèi)標基因的篩選與鑒定.pdf

1、甘蔗是最重要的糖料作物，蔗糖占我國食糖總產(chǎn)量的90％以上，甘蔗生產(chǎn)關(guān)系我國食糖安全。甘蔗生產(chǎn)面臨寒、旱和病蟲害等逆境脅迫嚴重，提高甘蔗栽培品種的抗逆性是提高單產(chǎn)的重要手段。考慮到甘蔗為異源多倍體和非整倍體植物，遺傳背景復雜，優(yōu)良基因聚合重組的概率僅1/300000，而轉(zhuǎn)基因甘蔗為安全風險等級最低的作物之一，又是營養(yǎng)繁殖作物，屬于轉(zhuǎn)基因改良容易成功的作物，因此，轉(zhuǎn)基因?qū)⒂型鳛楦收崞贩N抗逆性改良的有效途徑和甘蔗育種新手段，而外源基因在轉(zhuǎn)基

2、因植株中的穩(wěn)定表達與外源基因拷貝數(shù)有密切關(guān)系，轉(zhuǎn)基因育種需要高通量的外源基因拷貝數(shù)檢測技術(shù)。經(jīng)典的Southern雜交技術(shù)存在費力、耗時和需要大量DNA等問題，且對于發(fā)生重排的外源基因拷貝數(shù)的測定不夠準確，因此，近年已在多種植物中建立了利用定量PCR進行基因拷貝數(shù)檢測的技術(shù)，該技術(shù)具有快速、高效和高通量的特點。另一方面，基因成分檢測是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品商業(yè)化過程中安全管理與監(jiān)控最重要的內(nèi)容之一，隨著世界上第一例轉(zhuǎn)基因甘蔗在2013年獲準進行商業(yè)

3、種植，對轉(zhuǎn)基因甘蔗產(chǎn)品中基因成分檢測技術(shù)的需求更加迫切。而且，無論是轉(zhuǎn)基因甘蔗的外源基因拷貝數(shù)高通量檢測，還是轉(zhuǎn)基因甘蔗產(chǎn)品中基因成分檢測，均需要甘蔗源的內(nèi)標準基因。
　　為此，在國家自然科學基金項目支持下，本研究利用定性PCR和定量PCR技術(shù)相結(jié)合，在克隆獲得6個甘蔗源候選內(nèi)標準基因P4H，APRT，ENOL，CYC，TST和PRR的基礎(chǔ)上，以甘蔗ROC22和Badila基因組DNA為模板，對其相應的19對檢測引物進行特異性和擴

4、增效率評價，并進行種內(nèi)非特異性和種間特異驗證；在初步估算上述基因拷貝數(shù)的基礎(chǔ)上，篩選低拷貝內(nèi)標準基因，并在包括熱帶種、割手密野生種和現(xiàn)代甘蔗雜交種共8個不同甘蔗基因型上進行穩(wěn)定性分析。同時，通過構(gòu)建多靶標標準質(zhì)粒，在同一背景下進一步評價3個篩選出的低拷貝內(nèi)標準基因的拷貝數(shù)與穩(wěn)定性，并與經(jīng)典的Southern雜交方法進行比較，建立了高通量檢測基因拷貝數(shù)的方法。主要結(jié)果與結(jié)論如下：
　　1、以甘蔗ROC22和Badila基因組DNA為

5、初始模板，通過定性PCR擴增，克隆測序比對，篩選出特異的候選內(nèi)標準基因引物10對，分別是P4H基因的檢測引物P4H-1和P4H-3， ENOL基因的檢測引物ENOL-3，TST基因的檢測引物TST-1和TST-3，APRT基因的檢測引物APRT-1和APRT-2，CYC基因的檢測引物CYC-1和CYC-2以及PRR基因的檢測引物PRR-1。
　　2、利用定性PCR檢測技術(shù)，對所篩選的6個基因共10對引物在不同遺傳背景的甘蔗上進行種

6、內(nèi)非特異性鑒定，同時，在水稻、玉米、高粱、小麥、大豆、棉花、油菜、煙草、擬南芥以及甜菜上進行種間特異性鑒定，篩選出了具有甘蔗特異性和種間特異性的基因檢測引物7對，分別是P4H基因的檢測引物P4H-1和P4H-3，APRT基因的檢測引物APRT-1和APRT-2，CYC基因的檢測引物CYC-1和CYC-2以及PRR基因的檢測引物PRR-1。
　　3、以甘蔗ROC22和Badila基因組DNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，進一步

7、篩選出擴增效率高、特異性強的引物4對，分別是P4H基因的檢測引物P4H-3，APRT基因的檢測引物APRT-2，CYC基因的檢測引物CYC-2以及PRR基因的檢測引物PRR-1。
　　4、在比較4個候選內(nèi)標準基因拷貝數(shù)的基礎(chǔ)上，篩選出潛在的低拷貝基因3個，分別是P4H，APRT和CYC基因；并在包括熱帶種、割手密野生種和現(xiàn)代甘蔗雜交種共8個不同甘蔗基因型上進行穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明這3個基因在甘蔗基因組中，屬于甘蔗特異性和低拷貝基因

8、。
　　5、通過構(gòu)建多靶標標準質(zhì)粒，建立了P4H，APRT和CYC基因特異性定量方法，結(jié)果顯示，P4H，APRT和CYC基因在現(xiàn)代甘蔗栽培種ROC22基因組中的拷貝數(shù)分別為3，2和4，在熱帶種Badila基因組中分別為2，2和3，考慮到熱帶種為八倍體，現(xiàn)代栽培種中90%以上血緣來自熱帶種，說明了P4H，APRT和CYC基因是甘蔗基因組中的單拷貝或低拷貝基因。
　　6、為了比較定量PCR檢測與傳統(tǒng)的Southern雜交拷貝數(shù)鑒