大腸癌甲基化敏感基因的篩選與鑒定研究.pdf

1、目的： 本研究旨在篩選和鑒定一些大腸癌的甲基化敏感基因，為大腸癌的診斷和治療提供新策略。 方法： 利用MBD免疫沉淀結(jié)合啟動(dòng)子芯片方法在3對(duì)大腸癌及其外周非癌組織中篩選癌區(qū)特異性的甲基化基因。利用5-aza-dC處理結(jié)合表達(dá)芯片方法，在SW1116細(xì)胞中篩選和鑒定受甲基化調(diào)控的基因。采用MSP方法和real-timeRT-PCR方法在31對(duì)大腸癌組織中分別鑒定基因甲基化狀態(tài)和表達(dá)水平。在31對(duì)大腸癌及外周非癌組織

2、中用real-timeRT-PCR方法檢測(cè)ZNF278表達(dá)水平，COBRA方法分析基因甲基化狀態(tài)。構(gòu)建ZNF278表達(dá)載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞建立ZNF278過(guò)表達(dá)體系；siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染構(gòu)建ZNF278knockdown體系。CCK-8染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況。Hochest染色和AnnexinV流式方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況。 結(jié)果： 利用MBD免疫沉淀結(jié)合啟動(dòng)子芯片方法篩選并鑒定了6個(gè)甲基化敏感基因，包括

3、SST、EYA4、GSTM1、ZIC1、NXPH2和SYT6。這些基因的甲基化具有一定的腫瘤特異性和甲基化敏感性。利用表達(dá)芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SW1116細(xì)胞在經(jīng)過(guò)5-aza-dC處理后有253個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。定量PCR和MSP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在55％(17/31)的大腸癌組織中LRP15基因表達(dá)較外周非癌組織下調(diào)，LRP15基因甲基化密度在癌區(qū)77％(24/31)也較相應(yīng)外周非癌組織明顯升高。LRP15基因甲基化與其表達(dá)下調(diào)具有明顯的相關(guān)性(P＜0

4、.05)。ZNF278在48％的大腸癌組織中較相應(yīng)的外周非癌組織表達(dá)上調(diào)。相對(duì)于外周非癌組織，45％(14/31)的癌區(qū)組織是低甲基化的。大腸癌組織中ZNF278基因過(guò)表達(dá)可能與DNA低甲基化有關(guān)。通過(guò)ZNF278過(guò)表達(dá)和knockdown體系研究發(fā)現(xiàn)該基因促進(jìn)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，ZNF278基因下調(diào)使細(xì)胞生長(zhǎng)減慢細(xì)胞周期阻滯。 結(jié)論： MBD免疫沉淀結(jié)合啟動(dòng)子芯片方法和去甲基化藥物結(jié)合表達(dá)芯片方法均為有效的篩選甲基化敏感基