ERK-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)影響大腸癌DNA甲基化的in vitro 和in vivo研究.pdf

1、背景：腸黏膜細(xì)胞不斷脫落更新，易受細(xì)胞外異常信號(hào)的刺激而發(fā)生癌變。細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)通路ERK-MAPK和DNA甲基化異常在大腸癌變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，二者相互影響，是極具抗腫瘤潛力的治療靶點(diǎn)。迄今為止，從細(xì)胞學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)角度系統(tǒng)性研究ERK-MAPK信號(hào)通路（RAF/MEK/ERK）對(duì)大腸癌腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，這種影響是否通過(guò)DNA甲基化的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)有待進(jìn)一步證實(shí)。 目的：觀察ERK-MAPK信號(hào)通路對(duì)大腸癌細(xì)

2、胞增殖和細(xì)胞周期的影響，以及其抑制劑對(duì)小鼠大腸癌的防治效果，初步探討ERK-MAPK信號(hào)對(duì)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的分子機(jī)制，進(jìn)一步明確DNA甲基化是否受ERK-MAPK通路的調(diào)控，為大腸癌的分子治療提供理論基礎(chǔ)。 方法：培養(yǎng)人大腸癌細(xì)胞系SW1116和小鼠成纖維細(xì)胞系NIH 3T3，分別以人MEK基因和小鼠ERK基因?yàn)榘悬c(diǎn)構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。脂質(zhì)體法介導(dǎo)RAF基因表達(dá)載體pCMV-RAF和MEK siRNA表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW11

3、16細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，四唑藍(lán)（MTT）測(cè)定細(xì)胞活力，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化。 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和抑癌基因p16INK4A、p21WAF1和p27KIP1 轉(zhuǎn)錄水平。以Western blotting分析各組細(xì)胞內(nèi)以上基因的蛋白表達(dá)以及MEK1/2、ERK1/2磷酸化水平和細(xì)胞核增殖核抗原（PCNA）蛋白表達(dá)情況。亞硫酸氫鹽修飾DNA測(cè)序和甲基化特異性PCR（MSP）分

4、析抑癌基因啟動(dòng)子甲基化情況。體內(nèi)研究采用二甲肼誘導(dǎo)小鼠大腸癌模型，在造模過(guò)程中給予MEK抑制劑PD98059或ERK siRNA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)，觀察大腸腫瘤的大小和發(fā)生率，定量PCR和Western blotting檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因在正常組織和腫瘤組織的差異，MSP分析抑癌基因DNA甲基化情況。 結(jié)果：成功地構(gòu)建了人MEK siRNA表達(dá)質(zhì)粒和小鼠ERK siRNA表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染SW1116和NIH 3T3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率50％

5、~63％，抑制效率為76％~92％，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中ERK-MAPK信號(hào)通路激酶MEK或ERK表達(dá)下降，甚至消失；轉(zhuǎn)染RAF于SW1116細(xì)胞可激活ERK-MAPK通路激酶。 與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒相比，RAF可顯著提高細(xì)胞生長(zhǎng)活力，增加軟瓊脂集落形成數(shù)目和體積，明顯改變細(xì)胞周期分布，G1期細(xì)胞百分比減少，S期細(xì)胞百分比增加(P<0.05)；MEK siRNA部分逆轉(zhuǎn)了腫瘤的惡性程度，細(xì)胞活力和增殖力下降，細(xì)胞周期阻滯于G1期，S期細(xì)胞減少，細(xì)

6、胞形態(tài)狹長(zhǎng)，胞質(zhì)減少，排列較整齊。 RAF可促進(jìn)ERK-MAPK信號(hào)通路激酶MEK和ERK的磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展，上調(diào)甲基化酶Dnmt的表達(dá)，并伴有PCNA的表達(dá)升高，而細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21WAF1、 p16INK4A和p27KIP1降低。MEK siRNA可下調(diào)MEK和ERK及其磷酸化水平p-MEK和p-ERK的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，下調(diào)甲基化酶Dnmt1和PCNA蛋白表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞周期蛋白p21WAF1和 p1

7、6INK4A的轉(zhuǎn)錄和翻譯；MSP分析MEK siRNA可使抑癌基因p16INK4A去甲基化和p21WAF1部分去甲基化，測(cè)序分析進(jìn)一步證實(shí)了其啟動(dòng)子區(qū)CpG島呈低甲基化狀態(tài)。 PD98059可顯著降低小鼠大腸癌的發(fā)生率（25％），降低ERK-MAPK信號(hào)通路MEK和ERK的磷酸化水平，并降低甲基化酶Dnmt1和Dnmt3b的表達(dá)，誘導(dǎo)抑癌基因p21WAF1、 p16INK4A和p27KIP1的表達(dá)。ERK siRNA基因小鼠體內(nèi)