無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)高賴氨酸蛋白基因水稻的培育.pdf

1、水稻是一種主要的糧食作物，但其種子蛋白質(zhì)中賴氨酸的含量偏低，是第一限制性的氨基酸，嚴(yán)重限制人們對(duì)其它氨基酸的吸收利用。提高水稻種子中賴氨酸的含量能夠有效提高蛋白質(zhì)的整體利用率，在很大程度上增加稻米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，高賴氨酸水稻的培育具有重要的意義。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和新的高賴氨酸蛋白基因的發(fā)現(xiàn)使培育優(yōu)良的高賴氨酸水稻品種成為可能。與此同時(shí)，隨著轉(zhuǎn)基因植物的商品化生產(chǎn)，其安全性問題也日益引起人們的極大關(guān)注，其中選擇標(biāo)記基因的使用是安全性問題

2、的主要來源。
　　 基于以上問題，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法和雙T-DNA載體技術(shù)，將來源于大豆的高賴氨酸蛋白基因GsHLP2和GsHLP8(賴氨酸重量比分別為18.22％和19.93%)轉(zhuǎn)入水稻，篩選和培育無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)高賴氨酸蛋白基因水稻。
　　 取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.水稻轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化
　　 分別對(duì)供試水稻品種、水稻種子的成熟度、滅菌條件、愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)的培養(yǎng)條件、用于侵染的

3、水稻愈傷及分化時(shí)的篩選壓力作了優(yōu)化，結(jié)果表明：通育302、空育131和合江19三個(gè)水稻品種可以作為水稻遺傳轉(zhuǎn)化的材料，并且新鮮成熟的水稻種子更利于愈傷組織的誘導(dǎo)；25%次氯酸鈉(NaClO)20min+0.1%氯化汞(HgCl2)10min的滅菌條件對(duì)水稻愈傷誘導(dǎo)良好，而且光照條件下誘導(dǎo)的水稻愈傷在質(zhì)量和產(chǎn)率上都優(yōu)于黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷；愈傷繼代3～5次較直接轉(zhuǎn)化具有更好的分化率：確定侵染后的水稻愈傷分化階段篩選時(shí)雙丙氨膦(Bialap

4、hos)濃度為0.8 mg/L。
　　 2.遺傳轉(zhuǎn)化及T0代轉(zhuǎn)基因植株的獲得
　　 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將5個(gè)植物表達(dá)載體(pTTBUG2、pTTBUG8、pTTBGG2、pTTBGG8、pTTBUP2G2)導(dǎo)入供試水稻品種空育131、合江19、通育302中，共獲得轉(zhuǎn)化植株149株。
　　 3.T0代轉(zhuǎn)基因植株的篩選和檢測(cè)
　　 對(duì)所得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Basta抗性篩選，在苗期葉片涂抹50mg/

5、L的除草劑(Basta)，結(jié)果有124株轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)出一定的抗性。進(jìn)一步對(duì)具有Basta抗性的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得轉(zhuǎn)bar基因水稻88株，其中46株同時(shí)帶有高賴氨酸蛋白基因，陽(yáng)性率和共轉(zhuǎn)化率分別為70.1%和52.3%。
　　 4.T0代轉(zhuǎn)高賴氨酸蛋白基因水稻種子的氨基酸組成分析
　　 對(duì)所得的轉(zhuǎn)基因植株的T0代種子的氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：在檢測(cè)的6株轉(zhuǎn)基因植株中，其氨基酸的組成和含量并沒有明顯提高。在賴

6、氨酸占總氨基酸的百分比中，只有轉(zhuǎn)化植株HJ19*P2G2-23的賴氨酸比對(duì)照提高了5.14%。
　　 5.T1代轉(zhuǎn)基因植株的篩選和檢測(cè)
　　 將轉(zhuǎn)基因水稻的T1代種子接種于含有5 mg/L Bialaphos的1/2MS培養(yǎng)基中，30±1℃光照培養(yǎng)，一周后可見部分種子發(fā)芽后死亡不能正常生長(zhǎng)成植株，而部分轉(zhuǎn)基因水稻種子則表現(xiàn)出明顯的Bialaphos抗性。對(duì)所得的轉(zhuǎn)基因水稻株系通育302*U2-36的T0種子進(jìn)行溫室栽培，