以PMI基因為選擇標記露地菊轉PtDHAR基因體系的建立.pdf

1、露地菊(Chrysanthemum morifolium)是園林綠化觀賞植物中常用的花卉之一。其顯著的特點是植株低矮,覆蓋力強,繁殖容易,管理粗放,適應范圍廣,抗逆性強,花色豐富,花多而密,花期長,觀賞價值高。在我國東北鹽堿地區(qū)以及城市鹽漬化嚴重的地區(qū),大部分栽植的露地菊受鹽堿的影響則表現出葉色萎黃、生長不良、花芽分化受阻甚至死亡的現象。本研究旨在利用安全標記的遺傳轉化方法獲得轉化植株,培育出抗鹽堿能力更強的新品系,豐富鹽堿地區(qū)花卉種植

2、品種,提高鹽堿地區(qū)花卉種植業(yè)收益水平。
　　 研究利用Gateway技術,以磷酸甘露糖異構酶基因PMI為選擇標記,以鹽生植物星星草中克隆的耐鹽堿相關基因PtDHAR為目的基因,構建pCAMBIA1301-PMI-PtDHAR雙元表達載體,并將此載體轉入農桿菌菌株EHA105中,通過農桿菌介導的方法,把耐鹽基因PtDHAR轉入露地菊‘火焰’基因組中。
　　 主要研究結果如下:
　　 (1)遺傳轉化載體的構建。從大腸

3、桿菌中通過PCR克隆PMI基因全長,裝入pGEM(R)-T-Vector載體中,利用限制性內切酶XhoI單酶切,以PMI-T載體和pCAMBIA1301載體為基礎,構建pCAMBIA1301-PMI載體;利用Gateway技術構建pCAMBIA1301-PMI-PtDHAR雙元表達載體,并將此載體轉入到農桿菌菌株EHA105中,通過PCR驗證結果表明pCAMBIA1301-PMI-PtDHAR載體已成功轉入農桿菌菌株EHA105中。

4、r>　　 (2)露地菊‘火焰’對甘露糖和頭孢霉素的敏感性試驗。研究結果當甘露糖濃度為10 g/L時即能明顯抑制葉片外植體的分化和不定芽的產生,可以作為遺傳轉化時葉片外植體篩選培養(yǎng)的臨界耐受濃度;分化率和不定芽增殖系數隨著頭孢霉素(Cef)濃度的升高而逐漸下降,300 mg/L的Cef濃度可作為葉片外植體在共培養(yǎng)后抑制農桿菌的抑菌濃度。
　　 (3)露地菊‘火焰’遺傳轉化體系的建立。以預培養(yǎng)1d的葉片外植體為轉化材料,用OD60

5、0值為0.4的農桿菌菌液侵染10min,在23～25℃黑暗條件下共培養(yǎng)2d,隨后進行2d延遲培養(yǎng),接下來以300mg/L的Cef濃度為抑菌濃度,采用選擇壓遞增的方式進行篩選,初期篩選培養(yǎng)基的甘露糖濃度為8g/L,后期篩選培養(yǎng)基中甘露糖的濃度增加到10g/L,連續(xù)篩選至不定芽產生。把不定芽轉入甘露糖濃度為10g/L、Cef濃度為100mg/L的生根篩選培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選,直至長勢健壯并生根的抗性植株產生。
　　 (4)轉化植株的檢測