馬鈴薯(solanumtuberosuml.)花粉特異表達(dá)基因sblr的克隆、分析及對(duì)玉米的遺傳轉(zhuǎn)化

1、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)花粉特異表達(dá)基因SBLR的克隆、分析及對(duì)玉米的遺傳轉(zhuǎn)化姓名：郎志宏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：敖光明20030501A b s t r a c tT h eg a m e t o p h y t e ( p o l l e ng r a i n ) c o n t a i n sa l l t h eg e n e t i ci n f

2、o r m a t i o nr e q u i r e dt ou n i t ew i t ht h ef e m a l eg a m e t e a tf e r t i l i z a t i o na n d t of o r m a n e w s p o r o p h y t e ．Ar e l a t i v e l yl a r g en u m b e r o f g e n e s a r er e q u i

3、 r e dt op r o g r a mp o l l e nd e v e l o p m e n t ，I no r d e rt oe s t a b l i s ht h ep o l l e n - s p e c i f i cg e n ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s m ( s ) ，i tw i l lb e n e c e s

4、 s a r yt oi s o l a t ea n d c h a r a c t e r m o r e p o l l e n - s p e c i f i c g e n e s a n d p r o m o t e r s ．S c r e e n i n go f ap o t a t og e n o m i cl i b r a r yw i t haf u l l —l e n g t hS B 4 0 1e D

5、 N A r e s u l t e di nt h ei s o l a t i o no f s i xp o s i t i v ec l o n e s ．O n eo f c l o n e s ，d e s i g n a t e d7 0 1 ，w a sf u r t h e rc h a r a c t e r i z e d ．O v e r9K bS a c lr e s t r i c t i o nf r a

6、g m e n tw a sc l o n e di n t o p G E M ·7 Z f ( + ) ，m a p p e df o r r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s es i t e s a n da n4 ．5 K bf r a g m e n t w a s f u r t h e r s u b c l o n e d a n d s e q u e n c

7、 e d ．S e q u e n c ea n a l y s i s s h o w e d4 4 5 9 b pf r a g m e n tc o n t a i n s2 3 2 0 b pp u t a t i v e p r o m o t e rr e g i o nw i t h i n 5 ’u p s t r e a mo f t h eg e n o m i c c l o n e ．Ap u t a t i v

8、 eT A T A b o x a n dC A A T b o x w e r el o c a t e da t ．2 2 0 ～．2 1 4a n d_ 3 1 0 ～_ 3 0 6r e l a t i v e l y t ot r a n s l a t i o ns t a r ts i t e ．S B L Rg e n ec o n t a i n e dt h r e ee x o n sa n dt w oi n t

9、 r o n sa n de n c o d e dap r o t e i no f 2 1 1a m i n oa c i d s ，w h o s el y s i n ec o m p o s i t i o ni s 1 8 ．9 3 ％( w ／w ) ．S B L Rg e n ei s an a t u r a ll y s i n e - r i c hg e n e ，w h i c h h a sb e e n p

10、 a t e n t e d ．T od e t e r m i n ew h e t h e rt h i s 57 f l a n k i n gr e g i o nh a sp r o m o t e ra c t i v i t ya n d t oi n v e s t i g a t e i t s e x p r e s s i o np a t t e r n ，t h es e r i e so f f r a g

11、m e n t s _ 2 2 4 7 b p ，- 1 7 4 9 b p a n d 一1 3 3 8 b p w a sa m p l i f i e db yP C R a n d f u s e d t ot h ee n c o d i n gr e g i o no f 咖g e n e ．T h ep l a n te x p r e s s i o nc o n s t r u c t sw e r e t r a n

12、 s f o r m e di n t ot o b a c c op l a n t sb yA g r o b a c t e r i u r a ‘m e d i a t r a n s f o r m a t i o n ．T h et r a n s g e n i c p l a n t s w e r e a n a l y z e d b yP C Ra n dS o u t h e r nb l o w i n gt

13、ov e r i f yt h ep r e s e n c eo f G F P c o d i n g s e q u e n c e ．I nt h eG F P ．p o s i t i v ep l a n t s 、t h ee x p r e s s i o no f肋g e n eu n d e rt h e c o n t r o l o ft h eS B L Rp r o m o t e rw a sv i s u

14、 a l i z e d i n p o l l e n t u b e ．b u tn oo b v i o u se x p r e s s i o ni n o t h e rt i s s u e st h a th a v eb e e nd e t e c t e d ，l i k el e a v e s ，r o o t sa n ds t e m s ．T h es e q u e n c ew a sc o m p

15、a r e dw i t hn u c l e i ca c i dd a t a b a s e s ，G e n B a n k ，E M B La n dD D B J b yb l a s t ns e r v e r s ，n os i g n i f i c a n tm a t c h e st oa n yo t h e rs e q u e n c e sw a sf o u n d ，w a sr e g a r d

16、 e da san o v e lp r o m o t e r ．T h e s er e s u l t ss t r o n g l vs u g g e s t e d u s t h a tS B L R p r o m o t e r i sah o v e l p o l l e n - s p a c i f i cp r o m o t e r ．T of u r t h e r l o c a l i z ec ／s

17、 - e l e m e n t s r e g u l a t i n gS B L Rp r o m o t e ra c t i v i t y , t h e p r o g r e s s i v e 57 d e l e t i o n s a tp o s i t i o n 一1 2 1 2 ，一1 0 6 3 ，一8 4 2 ，- 7 4 2 ，- - 4 5 6 ，- 4 0 5 ，—3 4 5 ' - 0

18、6 9a n d - 2 1 5 w e r e f u s e d t ot h eG U S r e p o r tg e n e8 n d t h e p l a n t e x p r e s s i o n c o n s t r u c t s w e r es t a b l y i n t r o d u c e d i n t o t o b a c c ob yA g r o b a c t e r i u m ．m

19、 e d i at r a n s f o r m a t i o n S B L R p r o m o t e r a c t i v i t yw a s d e t e r m i n e db yf i u o r i m e t r i cG U S a s s a y sa n dh i s t o c h e m i c a la n a l y s e s ，a n dt h er e s u l t sd e m o

20、 n s t r a t e dt h e c ／s —e l e m e n tr e g u l a t o r yo f S B L R p r o m o t e r w a sc o n c e n t r a t e di nt h er e g i o n 一3 4 5t o —2 6 9 ．P l a n ‘e x p r e s s i o nV e c t o r1 9 Z K g H ( s e e d ‘s p

21、e c i f i cp r o m o t e r1 9 Z ：：S B L Rg e n o m i cD N A ) a n d A k g H ( A d h lp r o m o t e r ：：蹦月g e n o m i c D N A ) w e r et r a n s f o r m e d i n t o m a i z e e m b r y o n i cc a l l u s b ym i c r o p r