攜帶R-Spondin家族基因的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建與表達.pdf

1、R-Spondin家族蛋白（RSpos）是一類在脊椎動物胚胎及個體中普遍存在的分泌型糖蛋白。RSpo蛋白最主要的功能是作為Wnt/β-caternin經(jīng)典信號通路的激活物，參與調(diào)控一些依賴于該信號通路的下游基因表達。
　　 在某些由Wnt通路受阻引起的癌癥中，R-Spondin作為經(jīng)典Wnt信號途經(jīng)的激活劑，有望成為有效的治療成分，可作為針對癌癥的基因治療候選藥物。
　　 本研究以腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)AAV Helper-

2、free系統(tǒng)為基礎(chǔ)，擬構(gòu)建攜帶R-Spondin家族三個基因（R-Spondin1、RPE-Spondin、R-Spondin3）的重組腺相關(guān)病毒載體，包裝出含有目標基因的重組腺相關(guān)病毒，并通過病毒介導目標基因在宿主細胞里進行表達。
　　 通過PCR方法，將綠色熒光蛋白（EGFP）、myc抗原、6×His多標簽標記的R-Spondin融合基因擴增出來，將融合基因擴增產(chǎn)物插入到AAV表達質(zhì)粒pAAV-MCS多克隆位點中，構(gòu)建出重組

3、腺相關(guān)病毒載體。重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞制備重組病毒。重組病毒感染AAV-HT1080細胞，熒光顯微鏡以及Western blot檢測病毒介導的目標基因表達，流式細胞技術(shù)測定病毒滴度。
　　 重組病毒載體pAAV-RSpol-EGFP、pAAV-RPESpo-EGFP、pAAV-RSpo3一EGFP構(gòu)建成功，并成功包裝出具有侵染性的重組腺相關(guān)病毒rAAV-RSpo1