APOBEC3G在胰腺癌中分子機制及其關(guān)鍵靶蛋白研究.pdf

1、目的:
　　胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤，死亡率居第4位，發(fā)病隱匿、進展快、早期出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，但治療手段有限。闡明胰腺癌分子機制是治療胰腺癌的基礎(chǔ)和前提。近年研究提示病毒感染與消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，然病毒感染對腫瘤惡性生物學(xué)行為影響尚不明了。APOBEC酶作為一種常見的病毒感染反應(yīng)性蛋白，能使病毒DNA發(fā)生超突變，具有廣譜抗病毒能力。近來研究提示APOBEC蛋白不僅有抗病毒作用，而且在腫瘤中也有重要功能。本研究目的是通過篩選和鑒

2、定參與腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為的APOBEC家族成員;檢測APOBEC3G(A3G)在胰腺癌中的表達改變;改變A3G表達水平對胰腺癌細胞生物學(xué)行為影響的分子機制，以及鑒定其關(guān)鍵作用靶蛋白，從而明確A3G對胰腺癌惡性生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　采用全基因eDNA表達譜芯片篩選參與腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為的病毒相關(guān)蛋白。為探討A3G在胰腺癌表達情況，采用Real-time PCR檢測3株胰腺癌細胞系，11例配對胰腺癌及癌旁組

3、織中A3G mRNA水平;采用免疫組化和免疫熒光進一步驗證54例配對胰腺癌病理組織切片中A3G蛋白的表達情況。為評價A3G在胰腺癌中的作用，建立了穩(wěn)定表達A3G的胰腺癌細胞系，并觀察過表達A3G對裸鼠皮下移植瘤形成情況的影響。為研究A3G早期促進成瘤的分子機制，采用克隆球形成試驗、失巢凋亡(anoikis)實驗和流式檢測早期凋亡水平，并用western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達情況。為進一步研究A3G抑制anoikis的分子機制，我

4、們檢測了Akt通路活性，western blot檢測了Akt通路中關(guān)鍵抑制蛋白PTEN的表達，并用免疫共沉淀方法檢測A3G與PTEN的相互作用。同時采用熒光素酶雙報告基因方法檢測了Wnt通路活性，用免疫共沉淀篩選作用于Wnt通路的關(guān)鍵蛋白。我們進一步構(gòu)建各種結(jié)構(gòu)域突變體分析A3G與PTEN、FZD蛋白的結(jié)合位點。
　　結(jié)果:
　　基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)病毒感染反應(yīng)性蛋白A3G可能參與腫瘤惡性生物學(xué)行為;A3G在胰腺癌細胞和組織中表

5、達升高;高表達A3G早期可促進動物移植瘤的成瘤，晚期又能抑制腫瘤生長;體外研究發(fā)現(xiàn)A3G增加了抗凋亡蛋白Bcl-2，Mcl-1和phospho-Bcl-2的表達，顯著抑制胰腺癌細胞的anoikis;進一步發(fā)現(xiàn)過表達A3G是通過激活A(yù)kt激酶活性從而參與anoikis抵抗，A3G激活A(yù)kt通路是通過滅活PTEN蛋白活性實現(xiàn)的，A3G與PTEN結(jié)合需要A3G的CD2結(jié)構(gòu)域存在，PTEN與A3G結(jié)合需要PTEN的C2結(jié)構(gòu)域和PDZ結(jié)構(gòu)域的存在