Anxa5通過ERK1-2通路調(diào)控小鼠肝癌Hca-F細(xì)胞惡性行為.pdf

1、背景:惡性腫瘤的早期淋巴道轉(zhuǎn)移致患者死亡率高、預(yù)后差，其發(fā)生機(jī)制一直是腫瘤學(xué)的研究難題。膜聯(lián)蛋白A5(Annexin a5，Anxa5)是膜聯(lián)蛋白家族（Annexins）成員，為Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白。多項(xiàng)研究表明，Anxa5異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥性等密切相關(guān)。本課題組前期采用蛋白質(zhì)組學(xué)和基因芯片發(fā)現(xiàn)Anxa5在小鼠肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移力Hca-F細(xì)胞中高表達(dá)，并通過siRNA干擾技術(shù)下調(diào)Anxa5在Hca-F細(xì)胞中的表達(dá)，

2、獲得兩株下調(diào)率不同的單克隆細(xì)胞株，且Anxa5下調(diào)抑制Hca-F細(xì)胞的增殖能力。以上結(jié)果提示Anxa5可能是潛在的促進(jìn)肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的分子。
　　目的:1、探究Anxa5穩(wěn)定下調(diào)對Hca-F細(xì)胞侵襲、遷移、粘附能力的影響;2、探討Anxa5調(diào)控Hca-F細(xì)胞侵襲、遷移、增殖、粘附的分子機(jī)制，為腫瘤轉(zhuǎn)移治療提供理論基礎(chǔ)和作用靶點(diǎn)。
　　方法:1、實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)和Western blot檢測單克隆細(xì)胞株Hca-

3、F-shRNA1和Hca-F-shRNA2的Anxa5下調(diào)效率;2、Transwell小室和淋巴結(jié)原位雜交法檢測Anxa5下調(diào)對Hca-F細(xì)胞體外遷移、侵襲、粘附能力的影響;3、qRT-PCR和Western blot檢測Anxa5下調(diào)對增殖及侵襲、遷移相關(guān)分子c-jun、JNK、ERK、p38MAPK、AKT、MEK、E-cadherin表達(dá)變化的影響;4、Western blot檢測Anxa5下調(diào)對Hca-F細(xì)胞在ERK1/2抑制劑

4、PD98059作用后p-c-jun(Ser73)及E-cadherin表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:1、與Hca-F-shControl相比，兩株單克隆細(xì)胞Hca-F-shRNA1和Hca-F-shRNA2的mRNA水平下調(diào)率分別為72.3％和97.1％，蛋白水平下調(diào)率分別為43.9％和99.7％;2、與Hca-F-shControl相比，Hca-F-shRNA2細(xì)胞的遷移和侵襲分別降低了50.71％和49.84％(p＜0.05)，而H

5、ca-F-shRNA1細(xì)胞的遷移和侵襲能力無明顯變化(p＞0.05);3、與Hca-F-shControl相比，Hca-F-shRNA2細(xì)胞的淋巴結(jié)粘附能力顯著降低了61.71％(p＜0.01);4、Anxa5下調(diào)使p-ERK2的表達(dá)降低了92.7％(p＜0.01)，而對p-ERK1、JNK、p38MAPK、AKT、MEK無影響(p＞0.05）。5、Anxa5下調(diào)使p-c-jun(Ser73)表達(dá)降低了68.3％(p＜0.05);6、A

6、nxa5下調(diào)使E-cadherin在mRNA和蛋白水平分別升高了253.4％(p＜0.05)和808.0％(p＜0.001);6、PD98059明顯抑制Hca-F-shControl和Hca-F-shRNA2細(xì)胞p-ERK和p-c-jun(Ser73)的表達(dá)，同時顯著促進(jìn)Hca-F-shControl細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)，但對Hca-F-shRNA2細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)無明顯影響。
　　結(jié)論:1、Anxa5下調(diào)

7、到一定程度才可以抑制Hca-F細(xì)胞的體外侵襲和遷移能力;2、Anxa5下調(diào)抑制Hca-F細(xì)胞的體外淋巴結(jié)黏附能力，以此提示Anxa5下調(diào)可能會抑制Hca-F細(xì)胞的體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力;3、Anxa5下調(diào)通過抑制ERK而不是JNK，抑制p-c-jun(Ser73)的表達(dá)，以此來抑制Hca-F細(xì)胞的體外增殖能力;4、Anxa5下調(diào)通過抑制ERK促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，以此來抑制Hca-F細(xì)胞的遷移和侵襲能力;5、Anxa5通過ERK通