電針預(yù)處理通過CB1受體調(diào)節(jié)ERK1-2通路誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受.pdf

1、防治腦缺血/再灌注損傷，尋找有效的治療藥物及措施，促進(jìn)腦卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)，一直是生命科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，缺血前給予一定的預(yù)處理措施，能有效減輕缺血后的損傷，即缺血耐受(Ischemictolerance，IT)。近年來，已發(fā)現(xiàn)眾多不同的措施均能誘導(dǎo)產(chǎn)生缺血耐受效應(yīng)。
　　我們的研究已經(jīng)證實(shí)電針預(yù)處理可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生腦缺血耐受。新近的研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可以增加大鼠腦內(nèi)源性大麻素2-AG和AEA的含量，并上調(diào)大麻

2、素CB1受體，且CB1受體拮抗劑能夠逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受。然而CB1受體是通過何種途徑介導(dǎo)電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受效應(yīng)？越來越多的研究證明，CB1受體激活所介導(dǎo)的效應(yīng)，如神經(jīng)保護(hù)作用和抗焦慮作用均有ERK1/2通路的參與。已有大量研究證實(shí)，ERK1/2通路參與了許多預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受。那么CB1受體介導(dǎo)電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受效應(yīng)是否亦有ERK1/2通路的參與呢？本實(shí)驗(yàn)擬觀察ERK1/2通路是否參與重復(fù)電針預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠腦缺

3、血耐受，以及重復(fù)電針預(yù)處理是否通過CB1受體調(diào)節(jié)ERK1/2磷酸化水平誘導(dǎo)腦缺血耐受。
　　第一部分：ERK1/2通路激活參與電針預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受
　　實(shí)驗(yàn)一電針預(yù)處理對大鼠腦內(nèi)ERK1/2磷酸化水平的影響
　　目的：探討電針預(yù)處理對大鼠腦內(nèi)ERK1/2磷酸化水平的影響。方法：將20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組（Sham組）和電針組（EA組）。Sham組：行戊巴比妥鈉（40mg/kg，i.p.）麻醉；E

4、A組：腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉后取“百會”穴，選用疏密波、頻率2/15Hz、電流強(qiáng)度1mA，持續(xù)電刺激30min，以上處理每天1次，重復(fù)5天。分別在最后一次預(yù)處理后2h和24h，取大鼠右側(cè)大腦行Westernblotting檢測ERK1/2磷酸化（p-ERK1/2）水平。結(jié)果：最后一次預(yù)處理后2h，EA組p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平與Sham組相比明顯增高(P<0.05)；而最后一次預(yù)處理后24h，EA組p-ERK1/2蛋白

5、表達(dá)水平與Sham組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：重復(fù)電針預(yù)處理可以增高大鼠腦內(nèi)早期p-ERK1/2的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)二電針預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注后p-ERK1/2水平的影響
　　目的：研究重復(fù)電針預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注后p-ERK1/2水平的影響。方法：將25只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組)、對照組（CON組）和電針+缺血組（EA+MCAO組）。Sham組和CON組：行戊巴比妥鈉（40mg/kg，i.p

6、.）麻醉；EA+MCAO組：腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉后取“百會”穴，選用疏密波、頻率2/15Hz、電流強(qiáng)度1mA，持續(xù)電刺激30min，以上處理每天1次，重復(fù)5天。CON組和EA+MCAO組大鼠在最后一次預(yù)處理后24h，行短暫大腦中動脈阻塞(MCAO)致局灶性腦缺血模型(缺血2h)，再灌注2h和24h分別取右側(cè)大腦行Westernblotting檢測ERK1/2磷酸化（p-ERK1/2）水平。Sham組大鼠栓線不插入大腦中動

7、脈，其余操作同CON組。結(jié)果：CON組再灌注2h和24hp-ERK1/2蛋白表達(dá)水平較Sham組明顯增高(p<0.05)；EA+MCAO組再灌注2h和24hp-ERK1/2蛋白表達(dá)水平較CON組明顯增高(p<0.05)。結(jié)論：缺血再灌注后腦內(nèi)p-ERK1/2表達(dá)水平明顯增高，重復(fù)電針預(yù)處理可以進(jìn)一步增高缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)p-ERK1/2的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)三MEK1/2抑制劑對電針預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受的影響
　　目的

8、：探討MEK1/2抑制劑U0126對重復(fù)電針預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受的影響。方法：將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組(Sham組)、對照組（CON組）、電針+缺血組（EA+MCAO組）、U0126組、U0126+電針組（U0126+EA組）和DMSO+電針組（DMSO+EA組）。Sham組、CON組和EA+MCAO組的處理同實(shí)驗(yàn)二。U0126組腹腔注射MEK1/2抑制劑U01260.5mg/kg；U0126+EA組和DMSO+E

9、A組電針預(yù)處理前30min分別腹腔注射U01260.5mg/kg或20％DMSO0.6ml/kg。以上處理每天1次，重復(fù)5天。除sham組，其余大鼠均在最后一次預(yù)處理后24h，行短暫大腦中動脈阻塞(MCAO)致局灶性腦缺血模型（缺血2h），再灌注24h后，行神經(jīng)功能學(xué)評分（NFS）和腦梗死容積百分比測量。結(jié)果：(1)神經(jīng)功能學(xué)評分（NFS）：EA+MCAO組NFS明顯優(yōu)于CON組(p<0.01)；U0126+EA組與EA+MCAO組相比

10、明顯下降(p<0.01)；而U0126組與CON組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)腦梗死容積百分比：EA+MCAO組腦梗死容積百分比明顯小于CON組（p<0.01）;U0126+EA組腦梗死容積百分比與EA+MCAO組相比明顯增加（p<0.01）；而U0126組腦梗死容積百分比與CON組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：MEK1/2抑制劑可以逆轉(zhuǎn)重復(fù)電針預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受，表明ERK1/2磷酸化參與重復(fù)電針預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受。
　　第二

11、部分電針預(yù)處理通過大麻素CB1受體激活ERK1/2誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受
　　實(shí)驗(yàn)一CB1受體拮抗劑AM251對電針預(yù)處理后p-ERK1/2的影響
　　目的：探討CB1受體拮抗劑AM251對重復(fù)電針預(yù)處理后p-ERK1/2的影響。方法：將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham組)、電針組（EA組）、AM251組和AM251+EA組。Sham組和EA組的處理同第一部分實(shí)驗(yàn)。AM251組：腹腔注射AM2511mg/kg并

12、麻醉；AM251+EA組：電針預(yù)處理前30min腹腔注射AM2511mg/kg。分別在最后一次預(yù)處理后2h和24h取大鼠右側(cè)大腦行Westernblotting檢測ERK1/2磷酸化（p-ERK1/2）水平。結(jié)果：在最后一次預(yù)處理后2h，EA組p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平與Sham組相比明顯增高(P<0.05)；AM251+EA組與EA組相比，p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；而AM251組與Sham組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

13、異。結(jié)論：CB1受體拮抗劑AM251可以逆轉(zhuǎn)重復(fù)電針預(yù)處理引起的大鼠腦內(nèi)p-ERK1/2表達(dá)增強(qiáng)，表明重復(fù)電針預(yù)處理通過CB1受體激活ERK1/2通路。
　　實(shí)驗(yàn)二AM251對腦缺血再灌注后p-ERK1/2水平的影響
　　目的：CB1受體拮抗劑AM251對腦缺血再灌注后p-ERK1/2水平的影響。方法：研究雄性SD大鼠45只，隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(Sham組)、對照組（CON組）、電針+缺血組（EA+MCAO組）、AM25

14、1組和AM251+EA組。各組處理同第二部分實(shí)驗(yàn)一。各組大鼠在最后一次預(yù)處理后24h，行MCAO致局灶性腦缺血（2h）模型，再灌注2h和24h分別取大鼠右側(cè)大腦行Westernblotting檢測ERK1/2磷酸化（p-ERK1/2）水平。結(jié)果：缺血再灌注后2h和24h，EA+MCAO組p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平與CON組相比明顯增高(P<0.05)；AM251+EA組與EA+MCAO組相比p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0

15、.05)；而AM251組p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平與CON組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：CB1受體拮抗劑AM251可以逆轉(zhuǎn)重復(fù)電針預(yù)處理引起的大鼠腦缺血再灌注后p-ERK1/2表達(dá)增強(qiáng)，說明重復(fù)電針預(yù)處理通過CB1受體激活ERK1/2通路誘導(dǎo)腦缺血耐受。
　　小結(jié)：
　　1.重復(fù)電針預(yù)處理可增強(qiáng)早期大鼠腦內(nèi)p-ERK1/2表達(dá)，而CB1受體拮抗劑AM251可以逆轉(zhuǎn)重復(fù)電針預(yù)處理引起的大鼠腦內(nèi)p-ERK1/2的表達(dá)水平增高，表明

16、重復(fù)電針預(yù)處理通過CB1受體激活ERK1/2通路。
　　2.MEK1/2抑制劑U0126可以逆轉(zhuǎn)重復(fù)電針預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受，表明ERK1/2磷酸化參與重復(fù)電針預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受。
　　3.缺血再灌注后腦內(nèi)p-ERK1/2表達(dá)增強(qiáng)，重復(fù)電針預(yù)處理可以進(jìn)一步上調(diào)p-ERK1/2的表達(dá)水平；而電針預(yù)處理的p-ERK1/2表達(dá)增強(qiáng)可被CB1受體拮抗劑AM251逆轉(zhuǎn)，表明重復(fù)電針預(yù)處理通過CB1受體調(diào)節(jié)ERK1/2通路誘導(dǎo)