電針預(yù)處理通過EAAT2調(diào)節(jié)NDRG2誘導(dǎo)腦缺血耐受的研究.pdf

1、中風(fēng)是世界第二大致死性第一大致殘性疾病。因此需要開發(fā)有效地治療手段來預(yù)防中風(fēng)發(fā)生，同時(shí)減少缺血再灌注造成的損傷。電針是一種傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代電療結(jié)合的新的治療手段。由于針刺對(duì)于很多心腦疾患都有很好的療效，電針療法是對(duì)傳統(tǒng)針刺的一大提升。我們近年的研究顯示，電針能夠發(fā)揮預(yù)處理效應(yīng)，誘導(dǎo)腦缺血耐受。隨后的機(jī)制研究顯示，電針的預(yù)處理效應(yīng)涉及到許多信號(hào)通路，如提高抗氧化物活性、調(diào)節(jié)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)以及抑制凋亡。腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血后第一個(gè)受到損傷

2、，并啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響神經(jīng)元的轉(zhuǎn)歸。NDRG2表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，并可能參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，我們前期研究也證實(shí)NDRG2在腦缺血損傷后表達(dá)上調(diào)。但其在電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受中的作用以及上下游調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討NDRG2在電針預(yù)處理中的作用，并研究其上下游調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)一NDRG2在電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受作用的研究
　　目的：探討NDRG2在電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受中的作用
　　方法

3、：60只雄性SD大鼠，體重280-320g，隨機(jī)分為3組(n=20)：假手術(shù)組(Sham)：不插入栓線，其余處理同MCAO組；對(duì)照組(Con)：建立MCAO模型，再灌注24h后處死；EA組(EA)：?jiǎn)未坞娽槾碳ぃ碳ず?h行MCAO，再灌注后24h處死動(dòng)物。動(dòng)物處死后取材，用免疫熒光雙標(biāo)法定性觀察NDRG2蛋白的細(xì)胞分布，WesternBlot定量檢測(cè)NDRG2蛋白表達(dá)，RT-PCR半定量測(cè)NDRG2mRNA表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)法測(cè)NDR

4、G2的細(xì)胞定位，細(xì)胞凋亡用TUNEL法檢測(cè)。
　　結(jié)果：缺血再灌24h后，NDRG2表達(dá)上調(diào)且主要分布于缺血半影區(qū)的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞中，NDRG2mRNA的表達(dá)和蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致。NDRG2在假手術(shù)組主要定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿，單純?nèi)毖獣r(shí)則主要定位于胞核，電針預(yù)處理組NDRG2表達(dá)較缺血組減少，胞核與胞漿均存在定位。TUNEL與NDRG2雙標(biāo)結(jié)果顯示：NDRG2信號(hào)與TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞存在共定位，電針預(yù)處理組缺血半暗區(qū)TUNEL

5、與NDRG2雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較缺血組減少。
　　結(jié)論：電針預(yù)處理通過逆轉(zhuǎn)NDRG2表達(dá)上調(diào)減少凋亡，從而誘導(dǎo)腦缺血耐受。
　　實(shí)驗(yàn)二電針預(yù)處理通過EAAT2調(diào)節(jié)NDRG2表達(dá)的研究
　　目的：探討電針預(yù)處理是否通過EAAT2調(diào)節(jié)NDRG2表達(dá)
　　方法：100只雄性SD大鼠，體重280-320g，隨機(jī)分為5組(n=20)：假手術(shù)組(Sham)：不插入栓線，其余處理同MCAO組；單純?nèi)毖M(Con)：建立MCAO模型

6、，再灌注24h后處死；EA組(EA)：?jiǎn)未坞娽槾碳?，刺激?h行MCAO，再灌注后24h處死動(dòng)物；EAAT2激動(dòng)劑(CXT)組；EAAT2抑制劑(DHK)組。再灌注后24h評(píng)價(jià)神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分及腦梗死容積，動(dòng)物處死后取材，用免疫熒光雙標(biāo)法定性觀察NDRG2蛋白的細(xì)胞分布，WesternBlot定量檢測(cè)EAAT2及NDRG2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：CXT組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分明顯優(yōu)于MCAO組，DHK組與MCAO組組間比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。C

7、XT組腦梗死容積明顯小于MCAO組(P<0.01)，DHK組與MCAO組組間比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CXT組EAAT2表達(dá)高于MCAO組，DHK組與MCAO組組間比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CXT組NDRG2表達(dá)低于MCAO組，DHK組與MCAO組組間比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NDRG2主要分布于缺血半影區(qū)的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞中，在假手術(shù)組主要定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿，MCAO時(shí)主要定位于胞核，電針預(yù)處理組胞核與胞漿均存在定位，CXT組主要表達(dá)于胞漿

8、，DHK組多表達(dá)于胞核。
　　結(jié)論：電針預(yù)處理可通過上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中EAAT2的表達(dá)，抑制NDRG2的上調(diào)，從而減輕腦缺血損傷。
　　實(shí)驗(yàn)三2-AG通過NDRG2調(diào)節(jié)STAT3在腦缺血耐受中作用的研究
　　目的：探討2-AG通過NDRG2調(diào)節(jié)STAT3在腦缺血耐受中的作用
　　方法：培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞，構(gòu)建氧糖剝奪OGD模型模擬腦缺血。細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSRL-SIH1-H1-GFP后行OGD，對(duì)照組不施行OGD

9、，其余同實(shí)驗(yàn)組。MTT及LDH檢測(cè)細(xì)胞活力，WesternBlot檢測(cè)NDRG2及STAT3表達(dá)。隨后轉(zhuǎn)染pSRL-CDH1-GFP細(xì)胞后加入2-AG行OGD，MTT及LDH檢測(cè)細(xì)胞活力，WesternBlot觀察NDRG2及STAT3表達(dá)。
　　結(jié)果：MTT及LDH結(jié)果顯示，ODG后星形膠質(zhì)細(xì)胞活力較正常細(xì)胞降低，轉(zhuǎn)染pSRL-SIH1-H1-GFP組細(xì)胞活力與正常細(xì)胞無差異；與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，OGD后NDRG2、pSTA

10、T3蛋白水平上調(diào)，而pSRL-SIH1-H1-GFP轉(zhuǎn)染組NDRG2、pSTAT3蛋白水平低于ODG組。2-AG組細(xì)胞活力比OGD組細(xì)胞活力高，pSRL-CDH1-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，抑制了2-AG組的細(xì)胞生存；WesternBlot結(jié)果顯示，與OGD組相比，2-AG組NDRG2、pSTAT3表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)染pSRL-CDH1-GFP后，逆轉(zhuǎn)了2-AG對(duì)NDRG2、pSTAT3表達(dá)的抑制作用。
　　結(jié)論：2-AG通過減少NDRG2表達(dá)