電針通過(guò)α7nAChR調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)誘導(dǎo)腦缺血耐受的機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中是世界范圍內(nèi)第五大致死性病因，致死致殘率高，嚴(yán)重的影響了人們的生活，并且對(duì)家庭和社會(huì)造成了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管目前已經(jīng)有了大量關(guān)于腦卒中發(fā)病機(jī)制的研究，真正行之有效的臨床治療手段還是極度缺乏。因此，急需一種能夠有效防治腦卒中的新方法。腦卒中主要以缺血性腦卒中為主，占了全部腦卒中的80％以上，主要?jiǎng)用}的阻塞造成了缺血部位能量和氧氣缺失，引起細(xì)胞壞死崩解，壞死細(xì)胞釋放大量危險(xiǎn)信號(hào)導(dǎo)致大腦炎癥反應(yīng)的發(fā)生。劇烈的炎癥反應(yīng)是造成大腦繼發(fā)性損

2、傷的重要原因。然而，也有研究表明，抑制腦卒中后的神經(jīng)炎癥將會(huì)影響長(zhǎng)期大腦功能的恢復(fù)。因此，如何精確的調(diào)控腦卒中后的神經(jīng)炎癥將為腦卒中的治療帶來(lái)新曙光。
　　小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)免疫效應(yīng)細(xì)胞，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)抗外界損傷性刺激的第一道防線，小膠質(zhì)細(xì)胞的存在對(duì)于大腦具有非同尋常的意義。大腦發(fā)生炎癥反應(yīng)之后，常常伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。由于各種不同的刺激和外界環(huán)境的改變，小膠質(zhì)細(xì)胞可以激活為經(jīng)典激活狀態(tài)（M1型）發(fā)揮促炎作用，通常主要活躍在

3、腦缺血損傷后早期，加劇組織損傷；也可以激活為選擇性激活狀態(tài)（M2型）發(fā)揮抗炎作用，主要在腦缺血損傷后晚期發(fā)揮作用，促進(jìn)損傷組織修復(fù)。既然小膠質(zhì)細(xì)胞不同的表型發(fā)揮不同的作用，那么，從神經(jīng)保護(hù)的角度出發(fā)，通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，進(jìn)而減少具有神經(jīng)毒性的小膠質(zhì)細(xì)胞 M1型表達(dá)，增加神經(jīng)保護(hù)作用的小膠質(zhì)細(xì)胞M2型表達(dá)對(duì)于防治腦缺血損傷具有重要意義。
　　膽堿能抗炎通路通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)相互作用抑制炎癥反應(yīng)，其中煙堿型乙酰膽堿受體α

4、7亞單位（α7nAChR）在抗炎過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。α7nAChR廣泛表達(dá)于神經(jīng)元與各種非神經(jīng)元細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）表面。研究表明，激活小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞膜表面的α7nAChR可以抑制炎癥反應(yīng)，并且發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理可以有效地減輕腦缺血損傷，然而，其具體機(jī)制尚未完全闡明。那么，電針能否通過(guò)α7nAChR影響小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)，使其由促炎表型向抗炎表型轉(zhuǎn)化，從

5、而發(fā)揮腦保護(hù)作用呢？為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了如下研究。
　　實(shí)驗(yàn)一：電針預(yù)處理調(diào)控腦缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)
　　目的：觀察電針預(yù)處理是否會(huì)改變腦缺血半暗帶內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)
　　方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組（Sham）、腦缺血再灌注組（MCAO）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO）。缺血再灌注3天后將動(dòng)物處死，取其腦組織缺血半暗帶，通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)識(shí)分子的表達(dá)

6、水平。結(jié)果：Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，與MCAO組比較，EA+MCAO組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)識(shí)分子iNOS和IL-1β表達(dá)降低（P＜0.05, vs. MCAO），M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)識(shí)分子Arginase和TGF-β表達(dá)升高（P＜0.05, vs. MCAO）。
　　結(jié)論：電針預(yù)處理能改變腦缺血再灌注后半暗帶內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)，使小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化。
　　實(shí)驗(yàn)二：α7nAChR參與電針預(yù)處理對(duì)腦缺血

7、半暗帶內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的調(diào)控目的：通過(guò)實(shí)驗(yàn)一我們發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理能減少腦缺血再灌注后半暗帶內(nèi) M1型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)識(shí)分子的表達(dá)，增加 M2型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)識(shí)分子的表達(dá)，那么電針是通過(guò)什么機(jī)制造成了小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的改變呢？α7nAChR在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著重要的作用，本實(shí)驗(yàn)的主要目的是觀察電針預(yù)處理是否可以調(diào)控α7nAChR影響小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)。
　　方法：
　　1.α7nAChR激動(dòng)劑PHA-543,613對(duì)

8、腦缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的影響將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（Sham）、腦缺血再灌注組（MCAO）、α7nAChR激動(dòng)劑組（PHA-543,613+MCAO）、溶劑組（Vehicle+MCAO）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO）。腦缺血再灌注后3天取半暗帶組織，通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)識(shí)分子的表達(dá)水平。
　　2.α7nAChR抑制劑α-BGT對(duì)腦缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的影

9、響將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（Sham）、腦缺血再灌注組（MCAO）、電針預(yù)處理組（ EA+MCAO）、α7nAChR抑制劑組（α-BGT+EA+MCAO）、溶劑組（Vehicle+EA+MCAO）。腦缺血再灌注3天后取半暗帶組織，通過(guò)Western Blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)識(shí)分子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.與MCAO組比較，PHA-543,613+MCAO組和EA+MCAO組

10、的iNOS和IL-1β表達(dá)均減少，Arginase和TGF-β表達(dá)均增加（P＜0.05, vs. MCAO）。Vehicle+MCAO組與MCAO組之間并無(wú)顯著差異。
　　2.與EA+MCAO組比較，α-BGT+EA+MCAO組iNOS和IL-1β表達(dá)均增加， Arginase和TGF-β表達(dá)均減少（P＜0.05, vs. EA+MCAO）。Vehicle+EA+MCAO組與EA+MCAO組之間并無(wú)顯著差異。免疫熒光結(jié)果對(duì)West

11、ern Blot結(jié)果進(jìn)行了佐證。結(jié)論：電針預(yù)處理能夠通過(guò)α7nAChR調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)。
　　實(shí)驗(yàn)三：電針預(yù)處理調(diào)控α7nAChR減輕炎癥反應(yīng)和腦缺血損傷
　　目的：觀察調(diào)控α7nAChR改變小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)對(duì)缺血再灌注后腦內(nèi)炎癥因子、腦梗死容積、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響。
　　方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組（Sham）、腦缺血再灌注組（MCAO）、α7nAChR激動(dòng)劑組（PHA-543,613+MCAO）

12、、溶劑組（Vehicle+MCAO）、電針預(yù)處理組（EA+MCAO）、α7nAChR抑制劑組（α-BGT+EA+MCAO）。腦缺血再灌注后3天將動(dòng)物處死取材。通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)腦內(nèi)炎癥因子的變化，通過(guò)TTC染色、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（Garcia評(píng)分）評(píng)估腦功能。
　　結(jié)果：
　　ELISA結(jié)果顯示：與MCAO組相比較，PHA-543,613+MCAO組和EA+MCAO組其促炎因子TNF-α表達(dá)減少，而抗炎因子IL-10表達(dá)增

13、加(P＜0.05, vs. MCAO)；與EA+MCAO組相比較，α-BGT+EA+MCAO組其促炎因子 TNF-α表達(dá)增加，而抗炎因子IL-10表達(dá)減少(P＜0.05, vs. EA+MCAO)。
　　TTC染色結(jié)果顯示：與MCAO組相比，PHA-543,613+MCAO組和EA+MCAO組其腦梗死容積減少(P＜0.05, vs. MCAO)；與EA+MCAO組相比，α-BGT+EA+MCAO組腦梗死容積增加(P＜0.05, v

14、s. EA+MCAO)。
　　神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示：與 MCAO組相比， PHA-543,613+MCAO組和EA+MCAO組其神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較高(P＜0.05, vs. MCAO)；與EA+MCAO組相比，α-BGT+EA+MCAO組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較低(P＜0.05, vs. EA+MCAO)。
　　結(jié)論：α7nAChR激動(dòng)劑PHA-543,613可以模擬電針預(yù)處理的作用，平衡腦內(nèi)促炎因子和抗炎因子，減少腦梗死容積，增加

15、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，發(fā)揮腦保護(hù)作用；α7nAChR抑制劑α-BGT會(huì)使電針預(yù)處理產(chǎn)生的保護(hù)作用消失。
　　實(shí)驗(yàn)四：小膠質(zhì)細(xì)胞表面α7nAChR調(diào)控氧糖剝奪后小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)減輕神經(jīng)元損傷
　　目的：上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的神經(jīng)保護(hù)作用是否是通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞表面的α7nAChR發(fā)生的呢？本實(shí)驗(yàn)主要是從細(xì)胞功能的角度入手，進(jìn)一步佐證我們的科學(xué)假設(shè)。
　　方法：
　　1.尋找α7nAChR激動(dòng)劑PHA-543,613發(fā)揮細(xì)胞保

16、護(hù)作用的最佳有效濃度
　　以氧糖剝奪模型模擬腦缺血損傷。將純化后的原代小膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組（Control）、氧糖剝奪模型組（OGD）、OGD+PHA-543,6130.1μM、OGD+PHA-543,6131μM、OGD+PHA-543,61310μM、OGD+PHA-543,613100μM。復(fù)糖復(fù)氧24小時(shí)后取材，通過(guò) Western Blot技術(shù)檢測(cè) M2型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)識(shí)分子Arginase的表達(dá)情況。

17、
　　2.調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表面α7nAChR表達(dá)對(duì)氧糖剝奪后小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的影響
　　將原代小膠質(zhì)細(xì)胞分為5組，空白對(duì)照組（Control）、氧糖剝奪組（OGD）、α7nAChR激動(dòng)劑組（ PHA-543,613+OGD）、α7nAChR激動(dòng)劑加抑制劑組（PHA-543,613+α-BGT+OGD）、α7nAChR抑制劑組（α-BGT+OGD）。給予藥物提前預(yù)處理24小時(shí)后氧糖剝奪2小時(shí)，復(fù)糖復(fù)氧24小時(shí)取材使用Weste

18、rn Blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)IL-1β和Arginase的表達(dá)情況。
　　3.調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表面α7nAChR表達(dá)對(duì)氧糖剝奪后神經(jīng)元存活的影響
　　將原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞利用Transwell技術(shù)共培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為5組：空白對(duì)照組（Control）、氧糖剝奪組（OGD）、α7nAChR激動(dòng)劑組（PHA-543,613+OGD）、α7nAChR激動(dòng)劑加抑制劑組（PHA-543,613+α-BGT+OGD）

19、、α7nAChR抑制劑組（α-BGT+OGD），藥物預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞后與神經(jīng)元共培養(yǎng)，行氧糖剝奪2小時(shí)，復(fù)糖復(fù)氧24小時(shí)后檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞活力以及LDH釋放情況。
　　結(jié)果：
　　1. Western Blot結(jié)果顯示，當(dāng)PHA-543,613濃度為100μM時(shí)，能明顯的增加M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)識(shí)分子Arginase的表達(dá)（P＜0.05, vs. OGD），其他濃度之間并沒(méi)有明顯差異。因此，選取100μM這個(gè)濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理

20、細(xì)胞的有效濃度。
　　2. Western Blot結(jié)果顯示，與OGD組相比，PHA-543,613+OGD組IL-1β表達(dá)明顯下降，Arginase表達(dá)明顯增加（P＜0.05, vs. OGD）；PHA-543,613+α-BGT+OGD組和α-BGT+OGD組與OGD組并無(wú)明顯差異。免疫熒光結(jié)果對(duì)Western Blot結(jié)果進(jìn)行了佐證。
　　3.與 OGD組相比，PHA-543,613+OGD組神經(jīng)元活力增強(qiáng)，LHD釋放

21、減少（P＜0.05, vs. OGD）；PHA-543,613+α-BGT+OGD組和α-BGT+OGD組與OGD組并無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞表面α7nAChR可以使小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，有助于神經(jīng)元存活；而抑制α7nAChR則抑制了這種作用，不利于神經(jīng)元存活。
　　小結(jié)：通過(guò)以上研究我們發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理可以改變小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，使小膠質(zhì)細(xì)胞由促炎表型M1型向抗炎表型M2型轉(zhuǎn)化，平衡腦缺血再灌注后