TNF-α通過α7nACHR調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能.pdf

1、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，是一種能直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，不儀參與人胚胎血管生成，而且也參與出生后的血管新生及血管內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程。在炎癥反應(yīng)中，內(nèi)皮細(xì)胞不僅是參與者，還是首先受損的靶細(xì)胞，進(jìn)而造成微血管損傷、微循環(huán)障礙，這可能是器官功能障礙的始發(fā)環(huán)節(jié)。大量的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明：創(chuàng)傷時(shí)，循環(huán)及組織中的EPCs動(dòng)員、增殖，并分化為內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞，

2、從而改善微循環(huán)，增加器官供血；而如果創(chuàng)傷嚴(yán)重，發(fā)生EPCs的調(diào)節(jié)失代償，則會(huì)導(dǎo)致微循環(huán)的損傷無法修復(fù)，進(jìn)一步加重器官損害，直至功能衰竭，發(fā)生MODS。
　　 近年來，臨床上通過內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療心腦血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷等缺血性疾病取得了重要成功，顯示了廣闊的應(yīng)用前景。但是從在臨床應(yīng)用上也存在一定的限制：一是培養(yǎng)數(shù)量有限，不能滿足臨床治療需要；二是培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，容易導(dǎo)致延誤最佳的治療時(shí)間。
　　 煙堿樣乙酰膽堿受體

3、(nicotinic acetylcholine receptors，nAChR)α-7亞型屬于配體門控型離子通道受體，是迷走神經(jīng)激活的“膽堿能抗炎通路”的一個(gè)重要成分，機(jī)體能通過膽堿能抗炎通路調(diào)節(jié)炎癥過程中腫瘤壞死因子(TNF)、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)和其他細(xì)胞因子的水平。研究發(fā)現(xiàn)，在血管內(nèi)皮祖細(xì)胞表面表達(dá)α7nACHR，且對(duì)EPCs的功能調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。
　　 本研究通過對(duì)乙酰膽堿煙堿樣受體的干預(yù)觀察腫瘤壞死因子

4、(TNF-α)對(duì)EPCs調(diào)節(jié)作用的變化，研究闡明TNF-α通過α7nACHR發(fā)揮對(duì)EPCs的調(diào)節(jié)作用。為各種炎癥、創(chuàng)傷等引起的MODS的臨床預(yù)防、早期治療、甚至逆轉(zhuǎn)MODS病情進(jìn)展提供理論依據(jù)。
　　 本研究分為兩部分，首先從臍靜脈血分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定及檢測(cè)其增殖、遷移及成血管能力等；其次觀察TNF-α對(duì)EPCs的調(diào)節(jié)作用受α7nACHR的激動(dòng)劑及抑制劑的影響，探討腫瘤壞死因子對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制。全文共分兩個(gè)部分

5、：
　　 第一部分:臍靜脈血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：從臍靜脈血分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，為下一步研究打好實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：用密度梯度離心法從臍靜脈血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，按照1×106/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，使用添加了細(xì)胞因子和胎牛血清的內(nèi)皮祖細(xì)胞專用培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，在固定時(shí)間進(jìn)行消化、傳代和擴(kuò)增。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、免疫組化、流式細(xì)胞儀技術(shù)、乙?；牡兔芏戎鞍?D

6、il-Ac-LDL)和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1)的吞噬功能、體外血管生成功能等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定為正在分化的EPCs。Werstern Blot(蛋白免疫印跡法)檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)α7nACHR。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)2天后逐漸出現(xiàn)梭形貼壁細(xì)胞(attaching cells，ATcells)，第5天逐漸出現(xiàn)貼壁細(xì)胞聚集形成集落，到7-9天，貼壁細(xì)胞可鋪滿培養(yǎng)皿底。P4代EPCs電鏡觀察可見：細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到典

7、型的Weibel-Palade小體。超過80％體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞都特異性地?cái)z取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1。免疫組化結(jié)果顯示：CD133(+)、CD34(++)、CD31(+++)、KDR(+++)，CD133(+)、CD34(++)、CD31(+++)、KDR(+++)。流式細(xì)胞儀技術(shù)鑒定：CD133的陽性率：19.14±4.06％，CD34的陽性率：45.08±6.15％，CD31的陽性率：79.62±11.24％，

8、KDR的陽性率：85.32±12.09％。體外血管生成功能：22.92±8.62個(gè)/HP。粘附功能：貼壁率為53.04±4.80％。遷徙功能：遷徙率為14.41±1.65％。增殖功能：7天增殖細(xì)胞數(shù)是19.16±3.66×104。
　　 結(jié)論：以臍靜脈血為來源可以分離培養(yǎng)出的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定，具有典型內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)及各種功能，表面表達(dá)α7nACHR，為下一步的研究提供技術(shù)支持。
　　 第二部分：TNF-α通過α7n

9、ACHR調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的研究
　　 目的：旨在探討炎癥介質(zhì)對(duì)EPCs調(diào)節(jié)途經(jīng)是通過煙堿樣乙酰膽堿受體，為臨床應(yīng)用相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)選取10個(gè)培養(yǎng)皿，均加入TNF-α(100mg/L)，隨機(jī)選取其中5個(gè)作為A組，依次加入尼古丁(0、10-8、10-6、10-4、10-2mol/L)，標(biāo)為A1-5；其余5個(gè)分為B組，依次加入甲基牛扁亭堿(0、10-8、10-6、10-4、10-2mol/L)，標(biāo)為B

10、1-5。分別培養(yǎng)T1-3(12h、24h、48h)后行流式細(xì)胞儀檢測(cè)、Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1攝取實(shí)驗(yàn)、體外血管生成實(shí)驗(yàn)、EPCs增殖功能、粘附功能及遷徙功能檢測(cè)。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(陽性率)：A1-A5：CD133:18.67±4.06％，CD34:47.08±7.08％，CD31:82.16±8.89％，KDR：89.02±8.28％；B1-B5：CD133:16.19±6.04％，CD34:48

11、.12±6.34％，CD31:80.43±9.01％，KDR：87.24±9.12％。體外血管生成功能：A1-A5:20.02±4.67個(gè)/HP；B1-B5:10.38±7.55個(gè)/HP。粘附功能(貼壁率)：A1-A5:48.14±5.78％；B1-B5:29.08±5.12％。遷徙功能(遷徙率)：A1-A5:12.82±1.44％；B1-B5:4.87±0.82％。增殖功能：培養(yǎng)7天增殖細(xì)胞數(shù)：A1-A5:18.87±4.45×104

12、；B1-B5:4.12±1.02×104。
　　 結(jié)論：TNF-α可降低EPCs的增殖、遷移、黏附和體外血管形成能力，且受膽堿受體激動(dòng)劑及抑制劑影響，TNF-α可能通過乙酰膽堿能通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能。
　　 小結(jié)：機(jī)體在炎癥、創(chuàng)傷等過程中，體內(nèi)EPCs的數(shù)量減少及功能障礙可能是導(dǎo)致MODS發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。TNF-α作為重要的炎癥因子在此過程中起到不可或缺的作用。而TNF-α對(duì)EPCs數(shù)量及功能的調(diào)節(jié)，煙堿樣乙