雌激素調(diào)節(jié)骨骼源性內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)梗死心肌.pdf

1、心肌梗死是心力衰竭的主要原因。一些臨床研究顯示絕經(jīng)前的心力衰竭女性預(yù)后比相應(yīng)年齡的男性好。而且,多中心有關(guān)心力衰竭試驗的回顧性分析表明,使用雌激素的絕經(jīng)女性心力衰竭的預(yù)后比未使用雌激素的絕經(jīng)女性預(yù)后好,這些都提示雌激素對心血管系統(tǒng)具有保護作用。但隨機臨床試驗顯示雌激素會增加發(fā)生不良心血管事件的風(fēng)險,使在絕經(jīng)婦女中普遍使用雌激素替代治療的方案受到質(zhì)疑。然而,動物實驗研究和流行病學(xué)研究強烈提示雌激素對心血管系統(tǒng)有益,使得雌激素對心血管系統(tǒng)的

2、有益作用研究開始轉(zhuǎn)向新的可能機制和途徑,即近十年來始終是研究的熱點之一:內(nèi)皮祖細(xì)胞(endpthelia lprogenitor cells.EPCs)。
　　 EPCs修復(fù)梗死心臟主要是通過促進心肌梗死部位新生血管形成,增加血流灌注,促進組織再生,限制梗死部位疤痕發(fā)展,延緩心室重塑,從而改善心功能。在冠心病和有患冠心病危險因素的患者,EPCs的數(shù)量及其遷移、增殖、歸巢及血管新生等功能明顯降低。因此,在EPCs移植治療心肌梗死過

3、程中,如何提高EPCs的歸巢及其血管新生功能成為當(dāng)前研究的焦點。
　　 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)與其唯一受體CXCR4構(gòu)成的SDF-1α/CXCR4軸在EPCs歸巢及新生血管形成過程中起著重要作用。有關(guān)雌激素是否可通過作用于SDF-1α/CXCR4軸調(diào)節(jié)EPCs的歸巢和血管新生功能及其作用機制,目前研究尚少。由于全身應(yīng)用雌激素副作用大,且作用的組織細(xì)胞廣

4、泛,難以闡述清楚雌激素的具體作用機制。因此,本實驗首先通過建立卵巢切除模型,初步研究生理性雌激素對骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(bone marrow-derived endothelial progenitor cells,BM-EPCs)在體外向SDF-1α遷移和血管新生功能的影響及作用機制;然后在體外進一步研究雌激素預(yù)處理對BM-EPCs遷移和血管新生功能的影響及其作用機制;最后研究雌激素預(yù)處理BM-EPCs對其在移植治療心肌梗死中體內(nèi)歸巢

5、的影響,并研究雌激素預(yù)處理BM-EPCs在移植治療心肌梗死中的作用及其機制。
　　 第一部分生理性雌激素對骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移及血管新生功能的影響
　　 [目的]研究生理性雌激素對骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(BM-EPCs)遷移及血管新生功能的影響及其機制。
　　 [方法]6周齡雌性BALB/C小鼠隨機分成卵巢切除組、假手術(shù)組和正常組。分別于1周和4周后,ELISA法檢測各組小鼠血清雌激素濃度。4周后,取脛骨和股骨骨髓

6、,培養(yǎng)、鑒定BM-EPCs。Transwell小室檢測各組BM-EPCs經(jīng)或未經(jīng)CXCR4抑制劑AMD3100處理后向基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)的遷移功能。血管生成試驗檢測各組BM-EPCs經(jīng)或未經(jīng)CXCR4抑制劑AMD3100處理后形成管樣物的長度。RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測各組BM-EPCsCXCR4的表達(dá)。
　　 [結(jié)果]卵巢切除1周和4周后,卵巢切除組小鼠血清雌激素濃度(23.09

7、±4.01pmol/L)(20.75±2.75pmol/L)均明顯低于假手術(shù)組(894.53±71.98pmol/L)(910.18±58.77pmol/L)(P＜0.01)和正常組(867.52±77.08pmol/L)(901.66±78.57pmol/L)(P＜0.01),而假手術(shù)組和正常組無顯著差異(P＞0.05)。卵巢切除組BM-EPCs向SDF-1α遷移的數(shù)量(102.67±7.02/400倍視野)明顯低于假手術(shù)組(172.

8、00±9.17/400倍視野)(P＜0.01)和正常組(174.67±10.41/400倍視野)(P＜0.01),而假手術(shù)組和正常組無明顯差異(P＞0.05)。經(jīng)CXCR4抑制劑AMD3100處理后,卵巢切除組、假手術(shù)組和正常組向SDF-1α遷移的數(shù)量均明顯減少(55.33±5.51/400倍視野vs102.67±7.02/400倍視野)(57.00±4.58/400倍視野vs172.00±9.17/400倍視野)(60.00±5.00

9、/400倍視野vs174.67±10.41/400倍視野)(P＜0.01),但組間比較沒有顯著差異(P＞0.05)。卵巢切除組BM-EPCs形成管樣物的長度(5386±405μm/50倍視野)明顯低于假手術(shù)組(7768±466μm/50倍視野)(P＜0.01)和正常組(7514±547μm/50倍視野)(P＜0.01),而假手術(shù)組和正常組無顯著差異(P＞0.05)。正常組BM-EPCs經(jīng)CXCR4抑制劑AMD3100處理后,形成管樣物的

10、長度明顯降低(3292±310μm/50倍視野vs7514±547μm/50倍視野)(P＜0.01)。卵巢切除組BM-EPCsCXCR4的表達(dá)明顯低于假手術(shù)組和正常組(P＜0.01),而假手術(shù)組和正常組無顯著差異(P＞0.05)。
　　 [結(jié)論]生理性雌激素通過調(diào)節(jié)BM-EPCs功能性CXCR4的表達(dá)而增強其遷移及血管新生功能。
　　 第二部分雌激素預(yù)處理提高骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移及血管新生功能的體外實驗研究
　　

11、 [目的]研究體外雌激素預(yù)處理對骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(BM-EPCs)遷移及血管新生功能的影響及其機制。
　　 [方法]6周齡雌性BALB/C小鼠卵巢切除4周后,取脛骨和股骨骨髓,培養(yǎng)、鑒定BM-EPCs。分別采用0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L17β-雌二醇或相應(yīng)濃度17β-雌二醇和雌激素受體拮抗劑ICI182780與BM-EPCs共培養(yǎng)。48小時后,Transwell小室檢測各組BM-EP

12、Cs經(jīng)或未經(jīng)CXCR4抑制劑AMD3100處理后向基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)的遷移功能。血管生成試驗檢測BM-EPCs經(jīng)或未經(jīng)AMD3100處理后形成管樣物的長度。RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)和Westernblot檢測各組BM-EPCsCXCR4的表達(dá)。
　　 [結(jié)果]17β-雌二醇呈劑量依賴性增強BM-EPCs的遷移及CXCR4的表達(dá)(P＜0.05),但被雌激素受體拮抗劑ICI182780完全阻斷(P＞0.05)。同

13、樣,17β-雌二醇明顯增強BM-EPCs的血管新生功能(P＜0.05),但被雌激素受體拮抗劑ICI182780完全阻斷(P＞0.05)。經(jīng)CXCR4抑制劑AMD3100處理后,17β-雌二醇預(yù)處理的BM-EPCs的遷移和血管新生功能均明顯受損(P＜0.05)。
　　 [結(jié)論]雌激素通過雌激素受體途徑上調(diào)BM-EPCs功能性CXCR4的表達(dá)而增強其遷移及血管新生功能。
　　 第三部分雌激素預(yù)處理骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞提高細(xì)胞移

14、植治療急性心肌梗死療效的體內(nèi)實驗研究
　　 [目的]研究雌激素預(yù)處理骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(BM-EPCs)對其體內(nèi)歸巢及治療急性心肌梗死療效的影響。
　　 [方法]6周齡雌性BALB/C小鼠切除卵巢4周后,結(jié)扎前降支建立心肌梗死模型,RT-PCR及免疫組化檢測心肌梗死前和心肌梗死后1d、3d、7d、14d、21d心肌梗死區(qū)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)的表達(dá)。心肌梗死后3d小鼠分成3組,分別經(jīng)尾靜脈注射經(jīng)17β-雌

15、二醇預(yù)處理的BM-EPCs、未經(jīng)17β-雌二醇預(yù)處理的BM-EPCs和生理鹽水作為空白對照。BM-EPCs移植后4d、11d,MRI實時示蹤和普魯士藍(lán)染色分析心肌梗死區(qū)BM-EPCs的歸巢量。BM-EPCs移植后25d,超聲心動圖檢測3組小鼠的左室收縮末內(nèi)徑(LVDs)、左室舒張末內(nèi)徑(LVDd)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)和射血分?jǐn)?shù)(EF);免疫組化檢測3組小鼠心肌梗死區(qū)新生血管密度;Masson染色檢測3組小鼠左室纖維化面積與左室總面積的百分

16、比。
　　 [結(jié)果](1)心肌梗死后1d,SDF-1α表達(dá)即明顯增高;在心肌梗死后3d達(dá)高峰;心肌梗死后7d仍維持在較高水平(P＜0.01)。但在心肌梗死后14d、21d,SDF-1α表達(dá)明顯降低,與正常心肌中SDF-1α表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。(2)BM-EPCs移植后4d、11d,17β-雌二醇預(yù)處理組心肌梗死區(qū)中歸巢的BM-EPCs數(shù)量明顯高于未經(jīng)17β-雌二醇預(yù)處理組(P＜0.05)。(3)BM-EPCs移植

17、后25d,17β-雌二醇預(yù)處理組小鼠心室擴張程度明顯輕于空白對照組(LVDs:3.09±0.05vs3.27±0.10mm,P＜0.05:LVDd:4.18±0.07vs4.3±0.05mm,P＜0.05),未經(jīng)17β-雌二醇預(yù)處理組小鼠心室擴張程度與空白對照組無明顯差異(LVDs:3.18±0.07vs3.27±0.10mm,P＞0.05;LVDd:4.24±0.06vs4.31±0.05mm,P＞0.05)。17β-雌二醇預(yù)處理組小

18、鼠的心功能也好于空白對照組(FS,％:33±3.8vs26±3.2,P＜0.05),未經(jīng)17β-雌二醇預(yù)處理組小鼠的心功能與空白對照組無明顯差異(FS,％:28±4.7vs26±3.2,P＞0.05)。雖然17β-雌二醇預(yù)處理組和未經(jīng)17β-雌二醇預(yù)處理組小鼠EF值分別比對照組增加了4.72％和3.29％,但3組小鼠的EF值無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。(4)17β-雌二醇預(yù)處NBM-EPCs移植組心肌梗死區(qū)域新生血管密度明顯高于對照組

19、(1428±214/mm2vs1070±168/mm2,P＜0.05),未經(jīng)17β-雌二醇預(yù)處理BM-EPCs移植組心肌梗死區(qū)域新生血管密度與對照組無顯著差異(1214±157/mm2vs1070±168/mm2,P＞0.05)。(5)經(jīng)17β-雌二醇預(yù)處理BM-EPCs移植組左室纖維化面積占整個左室面積的百分比明顯低于對照組(8.8±4.9％vs49.0±4.6％,P＜0.05),而未經(jīng)17β-雌二醇預(yù)處理組與對照組無顯著差異(41.