心肌干細胞移植對大鼠心肌梗死心電生理影響的研究.pdf

1、本實驗研究目的是:了解大鼠CSCs電生理特性,觀察CSCs移植后對大鼠心肌梗死心電生理的影響。
　　 第1章心肌干細胞的分離,培養(yǎng),鑒定與誘導分化CSCs在心肌組織中數(shù)量極少。選擇一個有效的操作簡便的體外分離純化的方法,在CSCs研究中尤為重要。本實驗部分應用貼壁分離法對CSCs進行體外分離、純化培養(yǎng)和鑒定,并對CSCs進行誘導分化。
　　 1.1實驗目的:建立大鼠CSCs體外分離培養(yǎng)方法,為下一步研究CSCs離子通道和

2、觀察CSCs移植對大鼠心肌梗死心電生理的影響提供充足細胞資源。
　　 1.2材料與方法:取新生Sprague Dawley(SD)大鼠,在無菌條件下取心臟組織,采取貼壁分離和消化控制相結(jié)合辦法分離純化CSCs,觀察細胞形態(tài)變化。采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原:c-kit,CD29,CD90.1,CD11b/c,CD34,CD45的表達,進行CSCs鑒定。以及應用心肌球培養(yǎng)液誘導CSCs分化,并行細胞免疫化學檢測:肌鈣蛋白Ⅰ、α-

3、肌動蛋白和結(jié)合蛋白。
　　 1.3結(jié)果
　　 1.3.1 Po(原代)及P1代(經(jīng)過1次傳代為P1代,如此類推)細胞常有雜質(zhì)細胞。P2及P3代時,得到較純的CSCs。
　　 1.3.2流式細胞儀鑒定結(jié)果顯示:c-kit,CD29,CD90.1為陽性,CD11b/c,CD34,CD45為陰性。
　　 1.3.3 CSCs誘導分化結(jié)果:CSCs經(jīng)培養(yǎng)液誘導2周后,細胞免疫化學染色肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac t

4、roponinⅠ)、結(jié)合蛋白(desmin)和α-肌動蛋白(α-SarcomericActin)為陽性。
　　 1.4小結(jié)
　　 CSCs可以從心肌中分離,進行體外培養(yǎng)增殖。并且可以在體外誘導分化為心肌細胞。
　　 第2章心肌干細胞離子通道m(xù)RNA的表達與電流的檢測由于干細胞存在致心律失常性可能,干細胞的電生理特性成為研究熱點。
　　 實驗表明:CSCs分化為心肌細胞后,表現(xiàn)出和心室肌近似的電生理特性。然

5、而,大鼠CSCs在未分化為心肌細胞的狀態(tài)下,其離子通道表達和電生理特性尚不明了。
　　 2.1實驗目的:通過對CSCs離子通道m(xù)RNA表達和INa,Ica,Ito的檢測,了解CSCs離子通道表達進程和細胞電生理特性,為以后研究提供重要的實驗資料。
　　 2.2材料和方法:取P3代CSCs,提取RNA。予以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測CSCs離子通道KCNN3,CCHL2a,Kit2.1,Kv4.3,Kv3.1

6、,Kv2.1,Kv1.6,Kv1.3和rScn2a1的mRNA表達。膜片鉗全細胞記錄模式記錄CSCs是否存在INa,Ica,Ito電流。
　　 2.3結(jié)果
　　 2.3.1 CSCs離子通道m(xù)RNA:CCHL2a強表達,Kv4.3、Kv3.1中度表達,Kv2.1、Kv1.6、Kv1.3、Kir2.1低表達,KCNN3和rScn2a1極低表達。
　　 2.3.2膜片鉗全細胞記錄模式未檢測出CSCs存在INa,Ica

7、,Ito。
　　 2.4小結(jié)
　　 CSCs在未分化為心肌細胞的狀態(tài)下,已有離子通道m(xù)RNA的表達,但是膜片鉗全細胞記錄模式未檢測出離子電流存在。
　　 第3章心肌干細胞移植后對大鼠心肌梗死心電生理的影響隨著生物工程學發(fā)展,CSCs的發(fā)現(xiàn)和成功分離,使之成為新的研究熱點。CSCs移植被認為是治療心臟性疾病最好的種子細胞之一。實驗也顯示:CSCs移植后,對心肌梗死動物的心功能有明顯的改善,但是對心電生理的影響卻甚少

8、文獻報道。所以本實驗旨在觀察CSCs移植后對心肌梗死大鼠心電生理的影響。
　　 3.1實驗目的:觀察CSCs移植后對大鼠心肌梗死心電生理的影響。
　　 3.2材料與方法:26只雄性SD大鼠,建立心肌梗死模型,其中20只建模成功。2周后,20只心肌梗死大鼠隨機分為2組,每組10只,分別為心肌干細胞移植組和對照組(PBS組)。心肌干細胞移植組大鼠予以梗死區(qū)心肌內(nèi)注射CSCs(5×106/0.1 ml)0.1ml,對照組大鼠予

9、以梗死區(qū)心肌內(nèi)注射PBS0.1ml。6周后檢測以下數(shù)據(jù):心室有效不應期,心外膜單極電圖激動恢復時間與激動恢復時間離散度,惡性室性心律失常誘發(fā)率,室顫閾值(VFT)和心肌梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)CSCs縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達。
　　 3.3結(jié)果
　　 3.3.1在程序電刺激S1S2,S1S2S3條件下,CSCs移植后,對心室有效不應期影響無統(tǒng)計學差異。
　　 3.3.2 CSCs移植后,梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)的

10、校正激動恢復時間明顯縮短,校正激動恢復時間離散度明顯下降。
　　 3.3.3 CSCs移植后,心肌干細胞移植組更難誘發(fā)惡性室性心律失常。
　　 3.3.4.CSCs移植后,梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)VFT明顯提高。
　　 3.3.5CSCs移植組在大鼠梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)都可檢測到Cx43表達,并且與移植的細胞定位重疊。PBS組大鼠梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)Cx43表達極少。
　　 3.4小結(jié)
　　 3.

11、4.1 CSCs移植后,可以改善心肌梗死大鼠電生理異常狀態(tài),提高VFT。
　　 3.4.2 CSCs移植后,能夠在定植區(qū)表達Cx43。
　　 全文結(jié)論
　　 1 CSCs可以從心肌中分離,進行體外培養(yǎng)增殖。并且可以在體外誘導分化為心肌細胞。
　　 2 CSCs在未分化為心肌細胞的狀態(tài)下,已有離子通道m(xù)RNA的表達,但是膜片鉗全細胞記錄模式未檢測出離子電流存在。
　　 3 CSCs移植后,可以改善心