α7nAChR功能狀態(tài)在調控肥胖時促?；鞍椎挚怪械淖饔眉熬唧w機制.pdf

1、背景及目的
　　二十世紀90年代至今，科技的進步和經濟的飛速發(fā)展，生產力得到極大的提高，生活方式的改變，肥胖發(fā)生率在全球范圍內逐漸增高。肥胖以脂肪細胞體積增大、甘油三脂數(shù)量增多和慢性低度炎癥為特征，成為人類的健康殺手。脂肪組織不僅以甘油三脂的形式儲存能量，而且和其他內分泌器官一樣具有內分泌功能，大量分泌促?；鞍祝╝cylation stimulating protein, ASP）、瘦素、脂聯(lián)素等，該類物質統(tǒng)稱為脂肪因子。研究發(fā)

2、現(xiàn)，脂肪因子具有調節(jié)糖、脂代謝和胰島素的敏感性等功能,與機體胰島素抵抗、中心性肥胖等相關。促酰化蛋白（ASP）是近來備受關注的脂肪因子，它是由補體C3和因子B、因子D作用，分裂成C3a，然后C3a分裂產生C3adesArg(即ASP)。C5L2是ASP的受體，表達于脂肪、肝臟、骨骼肌、腎臟等組織。在脂肪細胞，ASP直接與 C5L2結合,激活 PLCβ,促進PKCα和PKCδ磷酸化蛋白的表達，提高DGAT的活性和促進GLUT4易位,通過P

3、LC以及PI3K-AKT，參與促?；鞍捉閷У母视腿サ暮铣伞?br>　　肥胖時，脂肪細胞合成甘油三酯的能力有限，未形成甘油三酯的脂肪酸從脂肪組織游離，并沉積于骨骼肌、肝臟等組織，導致靶器官的胰島素敏感性降低；高濃度的游離脂肪酸（FFA）誘發(fā)血脂紊亂并具有脂毒性，促進炎癥形成；脂肪因子功能發(fā)生轉化，激活補體系統(tǒng)，促進脂肪因子ASP大量產生，降低C5L2的表達、ASP和C5L2的結合率等環(huán)節(jié)，導致肥胖機體出現(xiàn)促?；鞍椎挚梗ˋSP res

4、istance），同時存在瘦素（leptin resistance）抵抗和胰島素抵抗(insulin resistance, IR)等，出現(xiàn)以血脂紊亂、心血管疾病、中心性肥胖、2型糖尿病為癥候群的代謝綜合征（MS）。
　　非神經元型膽堿能系統(tǒng)（non-neuronal acetylcholinergic system, NNAs）是一類存在于脂肪細胞，內皮細胞等多種非神經元細胞和組織中的膽堿能系統(tǒng)。非神經元型膽堿能系統(tǒng)通過遞質乙酰

5、膽堿與靶細胞上的膽堿能受體結合，參與調節(jié)細胞因子和激素的信息交流、細胞及周圍微環(huán)境的信號傳遞，廣泛調控體內生理、病理過程。脂肪組織通過自分泌和（或）旁分泌等方式分泌脂肪因子，并且脂肪因子與各組織、系統(tǒng)形成交互網(wǎng)絡，參與糖、脂代謝，免疫功能等?；罨巧窠浽湍憠A能系統(tǒng)可以改善胰島素敏感性，該作用與調控脂肪因子的表達密切相關。大量的研究發(fā)現(xiàn)尼古丁長期暴露使正常嚙齒類動物和吸煙者的體重較無尼古丁暴露者體重低，并且戒煙后體重增加；Liu等發(fā)現(xiàn)尼

6、古丁通過長期刺激 nAChRs調節(jié)脂肪因子的釋放，進而增加胰島素的敏感性；研究發(fā)現(xiàn)活化的α7型煙堿樣乙酰膽堿受體（α7nAChR）具有控制機體炎癥、降低體重、改善胰島素敏感性和調節(jié)細胞因子分泌等重要的功能；而缺乏α7nAChR，尼古丁刺激不能降低機體體重和改善胰島素抵抗，由此可知，α7nAChR在調控代謝參數(shù)方面具有舉足輕重的作用。研究α7nAChR介導的非神經元型膽堿能系統(tǒng)的活化在抑制ASP-C5L2信號通路促成脂作用，可為防治飲食源

7、性肥胖提供新的視角。
　　本文通過體內實驗和體外實驗主要研究α7 nAChR的功能狀態(tài)在調控ASP-C5L2信號通路合成甘油三酯的分子機制。在體內實驗，高脂飲食（HFD）誘導的肥胖模型小鼠接受尼古丁或（和）甲基牛扁亭堿或氧化六烴季銨注射3周，檢測不同組小鼠體重、血糖、血TG、血ASP水平，檢測C5L2 mRNA在不同組小鼠脂肪組織、肝臟、骨骼肌、腎臟等組織表達的影響；檢測α7nAChR蛋白在HFD小鼠和LFD小鼠脂肪組織表達的水平

8、；在體外實驗，對脂肪組織給予PNU282987預處理24小時和（或）渥曼青霉素（Wortmannin）預處理30分鐘，檢測活化α7nAChR介導的非神經元型膽堿能系統(tǒng)的活化對 ASP誘導的AKT/PKB Ser473磷酸化水平的影響。研究α7nAChR的功能狀態(tài)影響ASP-C5L2信號下游通路甘油三酯的合成，從而為尋找以α7nAChR作為治療肥胖以及肥胖相關并發(fā)癥的一個新的靶點提供理論依據(jù)。
　　方法
　　1. C57BL/

9、6J雄性小鼠（5-6W齡）隨機分為高脂飲食組（HFD組）和低脂飲食組（LFD組）。HFD組給予高脂飲食（D12492配方）、LFD組給予普通飲食，飼養(yǎng)16周-18周，期間間斷補充蛋黃、葵花籽等高蛋白食物。每天觀察小鼠的精神狀態(tài)，飲食、大小便，活動、皮毛色澤，每周換墊料、刷洗籠子、稱重并記錄。
　　2.喂養(yǎng)12周后的各組小鼠接受藥物注射。HFD組和LFD組分別分為4組：鹽水（NS）組、尼古?。∟IC）組、尼古丁和甲基牛扁亭堿（NIC

10、+MLA）組、尼古丁和氧化六烴季銨(NIC+HEX)組。NS組：生理鹽水10ml/kg/day，ip，Bid；NIC組：尼古丁1 mg/kg/day, ip，Bid；NIC+MLA組：甲基牛扁亭堿3 mg/kg/day, ip，Bid，尼古丁1 mg/kg/day, ip，Bid（甲基牛扁亭堿先于尼古丁30分鐘注射）；NIC+HEX組：氧化六烴季銨5 mg/kg/day, ip，Bid，尼古丁1 mg/kg/day, ip，Bid（氧化

11、六烴季銨先于尼古丁30分鐘注射）。給藥時間：9：30，21：30。連續(xù)給藥21d，并記錄每天的體重。
　　3.給藥結束，各組小鼠在取材前相繼接受腹腔注射葡萄糖耐量實驗（IPGTT）和腹腔注射胰島素耐量實驗（IPITT）,兩個實驗之間每組小鼠均有3天恢復期；經小鼠眼內眥靜脈取血，分別采用ELISA法檢測各組小鼠血促?；鞍祝ˋSP）的水平、采用GPO-PAP法檢測各組小鼠血甘油三脂（TG）的水平；取睪周脂肪組織、肝臟左外葉、腎臟、骨

12、骼肌等組織，采用熒光定量PCR法檢測C5L2mRNA在上述組織的表達水平。采用Western Blot檢測α7nAChR在HFD小鼠和LFD小鼠脂肪組織表達情況。
　　4.體外脂肪組織培養(yǎng)：脂肪組織分為4組，每組2個復孔。分為對照（PBS）組、酰化刺激蛋白（ASP）組、PNU282987+酰化刺激蛋白（PNU+ASP）組、PNU282987+渥曼青霉素+ASP（PNU+WOR+ASP）組。給予方法： ASP組：ASP100nM/L

13、，溫箱孵育10分鐘；PNU+ASP組：PNU28298710nM/L溫箱孵育24h，棄舊培養(yǎng)基，添加1ml新鮮的培養(yǎng)基，ASP100nM/L，溫箱孵育10分鐘；PNU+WOR+ASP組：渥曼青霉素200nM/L溫箱孵育30分鐘，棄舊培養(yǎng)基，添加1ml新鮮的培養(yǎng)基；PNU28298710nM/L溫箱孵育24h后，然后再次更換1ml新鮮培養(yǎng)基；添加 ASP100nM/L，溫箱孵育10分鐘。采用Western Blot檢測各組AKT/PKB

14、Ser73磷酸化水平。
　　5.采用 SPSS17.0軟件對各組實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用?x±s表示。實驗組和其對照組以及兩比較組間使用 t檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果
　　1. HFD小鼠和LFD小鼠的體重隨著喂養(yǎng)時間不斷增加，在喂養(yǎng)前4周，HFD組和LFD組小鼠的體重相比，差異無統(tǒng)計學意義。在第8周，與LFD組小鼠體重相比較，HFD小鼠體重顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.00

15、01)。
　　2.在3周經腹腔注射藥物始末，各組小鼠體重的增量比較：HFD小鼠NS組體重較LFD小鼠NS組體重顯著增加（P<0.05）。在HFD小鼠，NIC組小鼠體重較NS組小鼠體重明顯降低(P<0.001)；NIC+MLA組(P<0.05)以及NIC+HEX組(P<0.001)體重較NIC組顯著增加，NIC+MLA組小鼠體重較NIC+HEX組小鼠體重低（P<0.05)）。在LFD小鼠，NIC組體重較NS組降低(P<0.05)；N

16、IC組與NIC+MLA組、NIC+HEX組小鼠體重，三組之間差異無統(tǒng)計學意義。
　　3.各組血ASP和TG水平:HFD小鼠 NS組血TG水平較LFD小鼠 NS組明顯增高(P<0.05)。在HFD小鼠，NIC組血TG水平較NS組血TG水平明顯降低(P<0.05)； NIC+MLA組、NIC+HEX組較NIC組血TG水平顯著增高。在LFD小鼠，血TG水平在NS組、NIC組、NIC+MLA組、NIC+HEX組四組之間沒有顯著差異。

17、>　　HFD小鼠NS組血ASP水平較LFD小鼠 NS組血ASP水平明顯增高(P<0.05)。在HFD小鼠，NIC組血ASP水平較NS組血ASP水平明顯降低(P<0.05)；NIC組、NIC+MLA組和NIC+HEX組的血ASP水平，三組之間差異沒有統(tǒng)計學意義。在LFD小鼠，血ASP水平在NS組、NIC組、NIC+MLA組、NIC+HEX組四組之間沒有顯著差異。
　　4.血糖：與LFD NS組小鼠的空腹血糖相比較，HFD NS組小鼠

18、的空腹血糖較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在HFD小鼠，NIC組小鼠的空腹血糖水平與NS組小鼠的空腹血糖相比較，NIC組小鼠的空腹血糖水平低（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義；NIC組和NIC+MLA組、NIC+HEX組小鼠的空腹血糖，三組之間的空腹血糖水平差異沒有統(tǒng)計學意義。在LFD小鼠，NIC組小鼠的空腹血糖水平與 NS組小鼠的空腹血糖相比較， NIC組小鼠的空腹血糖水平低（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義。與NIC組小鼠的

19、空腹血糖水平比較，NIC+MLA組小鼠的空腹血糖（P<0.001）與 NIC+HEX組小鼠的空腹血糖（P<0.01）均較高，差異有統(tǒng)計學意義。
　　5. HFD小鼠NS組較LFD小鼠NS組具有較高的血葡萄糖水平，HFD小鼠NS組IPGTT曲線下面積更大；與NS相比，HFD小鼠和LFD小鼠的NIC組血葡萄糖水平低，NIC組具有明顯改善的IPGTT曲線。在HFD小鼠，NIC+MLA組較NIC組具有較高的血葡萄糖水平。在LFD小鼠，NI

20、C組、NIC+MLA組以及 NIC+HEX組的糖耐量，三組之間差異沒有統(tǒng)計學意義。HFD小鼠的糖耐量實驗，與NS組小鼠的血葡萄糖相比，NIC組小鼠的血葡萄糖水平在注射胰島素后30min,60min和90min顯著降低，NIC組、NIC+MLA組和NIC+HEX組之間血葡萄糖水平隨胰島素注射后時間變化沒有明顯差異。
　　6.與LFD小鼠AUC比較，HFD小鼠AUC顯著增多(P<0.01)。在HFD小鼠，NIC組AUC顯著小于NS組(

21、P<0.01)。NIC組、NIC+MLA組和NIC+HEX組三者的 AUC沒有明顯差異。在 LFD小鼠，NIC組 AUC小于 NS組 AUC(P<0.05)；NS組、NIC+MLA組和NIC+HEX組三者的AUC沒有明顯差異。
　　7. C5L2mRNA在各組睪周脂肪組織、肝臟左外葉、腎臟、骨骼肌等組織的表達情況：與 LFD小鼠NS組相比，HFD小鼠NS組C5L2mRNA在肝臟左外葉(P<0.01)、脂肪組織(P<0.001)、腎

22、臟(P<0.001)、骨骼肌組織(P<0.05)表達均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。在HFD小鼠，與NS組相比，NIC組C5L2基因在脂肪組織(P<0.05)、肌肉組織表達增高(P<0.05)，而在肝臟組織表達降低(P<0.001)；NIC+MLA組較NIC組C5L2基因在肝臟組織表達增加(P<0.01)。在LFD小鼠，與 NS組比較，NIC組 C5L2基因在脂肪組織（P<0.001）、肝臟（P<0.001）、骨骼肌(P<0.05)、腎臟

23、(P<0.001)表達降低；NIC+MLA組(P<0.001)和NIC+HEX組(P<0.01)較NIC組C5L2基因在肝臟組織表達較低。NIC+MLA組和NIC+HEX組與NIC組相比，C5L2基因在脂肪組織、腎臟組織、骨骼肌組織表達沒有明顯差異。
　　8.α7nAChR蛋白在小鼠脂肪組織表達，并且α7nAChR蛋白在HFD小鼠脂肪組織表達水平較在LFD小鼠脂肪組織表達低（P=0.0379），差異有統(tǒng)計學意義。
　　9.與

24、PBS組相比，ASP組Akt蛋白的磷酸化水平顯著增高( P=0.0379)，且差異具有統(tǒng)計學意義。PNU282987預孵育24小時，降低了ASP(P=0.0292)誘導的Akt磷酸化水平。渥曼青霉素+PNU282987+ASP組與ASP組兩組相比較，兩組Akt蛋白的磷酸化水平差異沒有統(tǒng)計學意義。
　　結論
　　α7nAChR介導的非神經元型煙堿樣膽堿能系統(tǒng)的活化通過 PI3K-AKT抑制ASP-C5L2下游信號通路促成酯作用