牙周炎對肥胖大鼠脂肪組織炎癥狀態(tài)的影響及其促胰島素抵抗機制初探.pdf

1、研究背景:
　　 肥胖作為一種亞健康狀態(tài)，與機體一些重要的生理指標密切相關，如血脂，血壓，胰島素敏感性等，它是促進機體發(fā)生某些慢性疾病如2型糖尿病(T2DM)和動脈粥樣硬化的重要病理特征[1]。肥胖狀態(tài)下，機體最早發(fā)生的，也是最重要的病理改變就是脂肪組織的增生肥大，尤其是內(nèi)臟脂肪。目前已知，脂肪組織不僅僅是一個能量儲存器官，而且是具有活躍分泌功能的內(nèi)分泌器官[2]。脂肪組織可以分泌大量的細胞因子，這些因子統(tǒng)稱為脂肪細胞因子，它們

2、作為炎癥介質(zhì)和信號分子參與機體的能量代謝，免疫調(diào)控和炎癥介導[3,4]。
　　 在眾多脂肪細胞因子中，腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)與白介素6(Interleukin6，IL-6)最早受到關注，并且被證實與胰島素抵抗和T2DM的病理機制有關。研究證實，在健康個體以及患有T2DM的個體體內(nèi)，脂肪組織中TNF-α的濃度均與空腹血糖，胰島素，甘油三酯的濃度以及胰島素抵抗有關[3，5，6]。IL-

3、6的表達在肥胖個體的脂肪組織中也明顯升高，并且是健康個體的10倍。脂肪組織是肥胖狀態(tài)下血清IL-6濃度的一個主要來源，30％的血清IL-6來自于脂肪組織。TNF-α和IL-6的聯(lián)合作用，增加了脂肪細胞中脂質(zhì)的溶解和脂肪酸的氧化，對脂肪組織的這種局部調(diào)控作用，最終促進了外周組織的胰島素抵抗[7-10]。近年來，更多新的脂肪細胞因子被發(fā)現(xiàn)并進行研究，其中瘦素和脂聯(lián)素受到的關注最多。瘦素經(jīng)脂肪細胞分泌，進入血循環(huán)，主要作用于下丘腦[11]，但

4、在胰島素敏感的外周靶器官如肝臟和骨骼肌中發(fā)現(xiàn)有瘦素受體的表達，說明瘦素參與了外周胰島素敏感性的調(diào)控。瘦素可通過自分泌和神經(jīng)內(nèi)分泌途徑兩種不同方式調(diào)控胰島素信號[12]。相反，脂聯(lián)素是所有脂肪細胞因子中唯一一個具有抗炎，保護血管內(nèi)皮功能和胰島素增敏作用[13-18]的細胞因子。脂肪細胞因子因此成為了聯(lián)系脂肪組織與全身病變，尤其是胰島素抵抗的關鍵紐帶。
　　 牙周炎是發(fā)生在口腔內(nèi)最常見的炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為牙周局部軟組織的破壞和骨

5、組織的吸收[19]。大量流行病學研究證實牙周炎與肥胖有關，縱向臨床研究也表明牙周炎的發(fā)展與體重指數(shù)(bodymassindex，BMI)的增加有關，并且使糖尿病患者糖化血紅蛋白的控制不[20-24]。在牙周炎，肥胖和T2DM之間，慢性炎癥狀態(tài)成為了其共同的病理機制。
　　 然而，牙周炎的局部炎癥反應是否能造成機體胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，或者在機體本身已存在病變?nèi)绶逝值那闆r下，牙周炎是否能加重機體的全身性的炎癥狀態(tài)，牙周炎參與胰島素

6、抵抗的調(diào)控機制是否與脂肪細胞因子有關，這些問題都尚未得到解決，而且人體學研究也無法完成這些研究。因此，我們采用建立疾病動物模型的方法，研究牙周炎對機體炎癥狀態(tài)的影響，以及這種影響是否與機體的胰島素有關，從而揭示牙周炎與T2DM病變發(fā)生發(fā)展的關系，為臨床治療和預防提供理論依據(jù)。
　　 第一章:牙周炎合并肥胖大鼠模型的建立
　　 目的:
　　 通過谷氨酸鈉(MSG)誘導建立肥胖大鼠模型，牙周局部結扎聯(lián)合涂菌建立牙周炎

7、模型;檢測肥胖大鼠的Lee's指數(shù)，血壓和血糖水平，評估大鼠的肥胖狀態(tài);Micro-CT掃描大鼠頜骨樣本并進行三維重建，計算牙周結扎造成的線性和體積骨喪失量;HE染色評估牙周組織的病理改變。
　　 方法:
　　 (1)80只新出生的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分為4組(n=20):牙周炎聯(lián)合肥胖組(OB+CP)，肥胖組(OB)，牙周炎組(CP)和正常對照組(C);
　　 (2)OB+CP組與O

8、B組的新生大鼠在出生后的第2，4，6，8，10天分別皮下注射MSG誘導肥胖，于12周齡時檢測體重，體長和血壓變化，取尾靜脈血測定空腹血糖濃度。判定肥胖模型成功建立的大鼠進入牙周炎模型的建立;
　　 (3)OB+CP組與CP組的大鼠在局麻下結扎雙側上頜第一，第二磨牙，結扎處涂布四種牙周致病菌的混懸液，誘導實驗性牙周炎8周;
　　 (4)20周齡時，處死所有實驗大鼠，采集血清和組織樣本，頜骨樣本采用Micro-CT掃描，ED

9、TA脫鈣和HE染色。
　　 結果:
　　 本實驗通過MSG藥物誘導新生大鼠，使其在成年期后表現(xiàn)出向心性肥胖，血壓升高，血糖異常等癥狀和體征，成功建立肥胖大鼠模型。采用絲線結扎雙側上頜磨牙并涂布牙周致病菌，經(jīng)8周的誘導，成功建立慢性牙周炎模型。兩種疾病模型在SD大鼠體內(nèi)成功復合。Micro-CT的三維重建顯示，結扎的牙周組織表現(xiàn)出明顯的線性和體積骨喪失量;HE染色切片顯示牙周組織附著喪失明顯，膠原纖維破壞，牙周袋底炎癥細胞

10、浸潤，肉芽組織形成，牙槽骨吸收明顯。
　　 結論:
　　 采用MSG誘導新生大鼠，可成功建立成年期肥胖大鼠模型，且該模型鼠表現(xiàn)出某些前糖尿病狀態(tài)的體征，該方法簡單，易行，重復性好，模型穩(wěn)定。絲線結扎聯(lián)合涂菌可誘導大鼠典型的牙周組織破壞，病理改變明顯，慢性炎癥狀態(tài)維持穩(wěn)定。
　　 第二章:牙周炎對大鼠內(nèi)臟脂肪組織炎癥狀態(tài)的影響
　　 目的:
　　 研究牙周炎對肥胖大鼠和非肥胖大鼠誘導內(nèi)臟脂肪組織的形

11、態(tài)學改變以及炎癥狀態(tài)變化的影響，探討牙周炎和肥胖對脂肪組織炎癥的聯(lián)合作用，為牙周炎參與調(diào)控肥胖相關性疾病的病理機制提供理論基礎。
　　 方法:
　　 四組大鼠的內(nèi)臟脂肪組織經(jīng)福爾馬林固定后，制成6um的切片，分別用于HE染色，甲苯胺藍染色和CD68/CD14的免疫組化染色。軟件分析四組大鼠脂肪細胞個數(shù)和直徑的變化，血管基質(zhì)成分的增生以及CD68/CD14標記的巨噬細胞的浸潤狀態(tài)。
　　 結果:
　　 四組

12、大鼠脂肪組織的HE染色結果顯示，和CP組與C組相比，OB+CP組與OB組大鼠的脂肪細胞數(shù)目增加，有顯著性差異(P＜0.05)，但OB+CP組與OB組之間(t=0.503，P=0.616)以及CP組與C組之間(t=0.215，P=0.830)的差別無統(tǒng)計學意義。OB組與OB+CP組的脂肪細胞直徑明顯大于C組和CP組，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但C組與CP組(t=0.480，P=0.632)，OB組與OB+CP組之間無統(tǒng)計學差異(t

13、=0.773，P=0.441)。甲苯胺藍染色顯示OB+CP組大鼠脂肪組織中的血管基質(zhì)部分出現(xiàn)明顯的增生擴張和炎癥細胞浸潤，而CP組的變化不明顯。比較四組大鼠脂肪組織中巨噬細胞的浸潤，OB+CP組的CD68蛋白表達明顯優(yōu)于OB組（t=3.944，P=0.000），且CP組的蛋白表達量也高于C組，差別有統(tǒng)計學意義（t=8.332，P=0.000）。脂肪組織中CD14蛋白的表達分析顯示，OB+CP組的平均光密度值高于OB組，有顯著統(tǒng)計學差異(

14、t=5.051，P=0.000);CP組與C組的脂肪組織內(nèi)偶見陽性染色細胞，CP組的平均光密度值高于C組，差別有統(tǒng)計學差異（t=3.382，P=0.000）。肥胖和牙周炎對大鼠脂肪組織中CD14蛋白的表達存在交互作用(F=7.481，P=0.007)。
　　 結論:
　　 肥胖可造成大鼠脂肪細胞的個數(shù)增加，體積增大，血管基質(zhì)擴張，炎癥細胞浸潤。而單純牙周感染，并不能引起脂肪細胞發(fā)生明顯的增生和肥大，但能使脂肪組織表現(xiàn)出輕

15、度的炎癥狀態(tài)，表現(xiàn)為脂肪組織中的血管基質(zhì)部分輕度增生，巨噬細胞浸潤增加。在聯(lián)合了肥胖后，牙周炎可使脂肪細胞發(fā)生更明顯的增生和肥大，并且血管基質(zhì)部分增生擴張更明顯，巨噬細胞浸潤更嚴重。基于以上證據(jù)，我們認為，慢性牙周炎癥可引起脂肪組織的輕度炎癥性改變，但不發(fā)生明顯的形態(tài)學變化，但在機體本身存在炎癥的前提下，牙周炎對脂肪組織炎癥的加重具有促進作用。
　　 第三章:牙周炎對脂肪細胞因子表達的影響及其與胰島素抵抗的關系
　　 目

16、的:
　　 檢測肥胖和非肥胖狀態(tài)下，牙周炎對瘦素和脂聯(lián)素這兩個關鍵的脂肪細胞因子在脂肪組織中表達的影響和血清濃度變化的影響，并分析這兩個脂肪細胞因子的局部和全身水平與機體胰島素抵抗的關系。
　　 方法:
　　 采用免疫熒光的方法標記四組大鼠脂肪組織中瘦素和脂聯(lián)素蛋白表達的變化，進行半定量分析;ELISA法檢測大鼠血清中瘦素，脂聯(lián)素和胰島素的濃度;葡萄糖氧化酶法檢測血清中空腹血糖的濃度。根據(jù)空腹胰島素(mIU/L)

17、和空腹血糖(mmol/L)濃度計算穩(wěn)態(tài)模型下的胰島素抵抗指數(shù)(homeostasismodelassessment-insulinresistance，HOMA-IR)，并采用Pearson相關分析評估瘦素和脂聯(lián)素在脂肪組織和血清中的表達水平是否與機體的胰島素抵抗有關。
　　 結果:
　　 瘦素蛋白在OB+CP組大鼠脂肪組織中的表達量最高，顯著高于OB組（t=2.046，P=0.044）;CP組大鼠脂肪組織中的瘦素蛋白表

18、達高于C組，差別有統(tǒng)計學意義(t=5.237，P=0.000);血清中的瘦素水平與脂肪組織中的表達水平一致，OB+CP組高于OB組（t=11.197，P=0.004），CP組高于C組（t=7.156，P=0.000），差別有顯著的統(tǒng)計學差異。脂聯(lián)素蛋白在C組大鼠脂肪組織中的表達量最高，而OB+CP組中最低，CP組的脂聯(lián)素蛋白表達量顯著低于C組(t=-3.661，P=0.000)，OB+CP組低于OB組(t=-2.932，P=0.004)

19、，有顯著統(tǒng)計學差異;但OB+CP組的血清脂聯(lián)素濃度最高，高于OB組(t=3.624，P=0.003)，而CP組的血清脂聯(lián)素濃度略低于C組，但無顯著性統(tǒng)計學差異（t=-1.323，P=0.207）。肥胖和牙周炎對脂肪組織中瘦素蛋白的表達(F=14.859，P=0.001)以及血清中瘦素（F=54.254，P=0.000）和脂聯(lián)素水平（F=5.191，P=0.024）存在交互效應。
　　 OB+CP組大鼠的空腹血糖濃度高于OB組，差

20、別有顯著統(tǒng)計學差異(t=7.694，P=0.000)，CP組的血糖稍高于C組，差別有統(tǒng)計學意義（t=3.369，P=0.005）。胰島素的血清濃度在OB+CP組比OB組稍高，但無統(tǒng)計學差異（t=0.658，P=0.521）;CP組血清中胰島素濃度高于C組，有統(tǒng)計學差異（t=6.462，P=0.000）。肥胖和牙周炎對空腹血糖存在交互作用(F=17.699，P=0.000)，但對胰島素水平不存在交互作用(F=1.606，P=0.215)。

21、
　　 HOMA-IR的評分顯示，從高到低依次為:OB+CP組＞OB組＞CP組＞C組。其中，OB+CP組的HOMA-IR得分高于OB組，差別有統(tǒng)計學意義(t=5.662，P=0.000);CP組的HOMA-IR得分高于C組，差別有統(tǒng)計學差異（t=9.992，P=0.000）。肥胖和牙周炎對大鼠HOMA-IR得分存在交互效應(F=12.340，P=0.002)。大鼠脂肪組織中瘦素的表達水平與HOMA-IR呈正相關(r=0.844,

22、P=0.000)，隨著瘦素在局部脂肪組織中表達量的增多，大鼠機體的胰島素抵抗水平增高;脂肪組織中脂聯(lián)素蛋白表達水平與HOMA-IR呈負相關（r=-0.886，P=0.000），隨著脂肪組織中脂聯(lián)素蛋白表達的降低，胰島素抵抗水平升高;大鼠血清中的瘦素（r=0.875，P=0.000）和脂聯(lián)素(r=0.735，P=0.000)水平與HOMA-IR也呈正相關，隨著瘦素和脂聯(lián)素血清水平的不斷升高，大鼠機體的胰島素抵抗也加重。
　　 結論

23、:
　　 慢性牙周炎可誘導大鼠脂肪組織中瘦素和脂聯(lián)素蛋白的表達失調(diào)，這種影響在合并了肥胖以后更為明顯。瘦素和脂聯(lián)素的血清濃度也受牙周炎的調(diào)控，并且牙周炎以及牙周炎聯(lián)合肥胖所造成的瘦素和脂聯(lián)素在局部和血清中水平的變化，與機體的胰島素抵抗密切相關，說明牙周炎可能通過調(diào)控脂肪組織表達瘦素和脂聯(lián)素，參與了機體胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。
　　 第四章:牙周炎對骨骼肌中脂肪細胞因子受體表達的影響
　　 目的:
　　 研究

24、各實驗組大鼠骨骼肌中瘦素受體和脂聯(lián)素受體1蛋白的表達，探討牙周炎對胰島素靶組織中脂肪細胞因子受體表達的調(diào)控以及在骨骼肌胰島素抵抗中的作用。
　　 方法:
　　 采用免疫組化的方法標記四組大鼠骨骼肌組織中瘦素受體和脂聯(lián)素受體1蛋白的表達，并進行半定量分析。
　　 結果:
　　 瘦素受體在C組和CP組的骨骼肌中廣泛表達，染色呈強陽性，而在OB組和OB+CP組骨骼肌組織中表達量減少，表達強度減弱，尤其是OB+C

25、P組中表達量最少。半定量分析顯示CP組與C組，蛋白表達量無顯著統(tǒng)計學差異(t=0.272，P=0.786);但OB組中，瘦素受體的表達量顯著高于OB+CP組，差別有統(tǒng)計學意義（t=-3.490，P=0.001）。肥胖和牙周炎對骨骼肌中瘦素受體的表達存在交互效應（F=4.341，P=0.039）。
　　 OB+CP組大鼠骨骼肌中脂聯(lián)素受體1蛋白的表達最弱，而且表達量明顯低于OB組，差別有顯著的統(tǒng)計學意義（t=-3.470，P=0.

26、001）;CP組和C組骨骼肌切片中可見肌細胞的胞膜廣泛表達脂聯(lián)素受體1，但兩組之間的蛋白表達量未見顯著的統(tǒng)計學差異(t=0.543，P=0.598)。肥胖和牙周炎對大鼠骨骼肌中脂聯(lián)素受體1的表達存在交互效應(F=6.364，P=0.013)。
　　 結論:
　　 牙周炎的局部感染不能下調(diào)大鼠骨骼肌組織中瘦素受體和脂聯(lián)素受體1的表達，但在肥胖狀態(tài)下，牙周炎可促進大鼠骨骼肌中瘦素受體和脂聯(lián)素受體1的表達明顯下調(diào)，這可能造成骨