EGF-EGFR介導(dǎo)ALC1促肝癌細(xì)胞惡性表型轉(zhuǎn)變.pdf

1、研究背景與目的：
　　肝細(xì)胞癌發(fā)病率及死亡率高，是世界公認(rèn)的最常見的惡性腫瘤之一，死亡率僅次于肺癌和胃癌，5年生存率僅為5％左右。HCC發(fā)病隱匿，病程進(jìn)展快、早期診斷困難，對(duì)放化療不敏感。過去的幾十年在肝細(xì)胞癌的治療方面取得了一定的進(jìn)展，但是依然無法解決肝癌易復(fù)發(fā)和5年生存率低等問題。因此有效阻斷肝癌進(jìn)展和尋找特異性治療方法依然是目前亟待解決的問題。ALC1基因位于染色體1q21，有一個(gè)SNF2_N結(jié)構(gòu)域和解旋酶超家族結(jié)構(gòu)域，編碼

2、897個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。研究表明在肝癌、肺癌和胃癌等實(shí)體瘤中高表達(dá)，與腫瘤預(yù)后正相關(guān)，另有研究報(bào)道ALC1在胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞中均有表達(dá)，與細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)，故以ALC1為靶標(biāo)的治療存在局限性。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）是強(qiáng)力細(xì)胞分裂促進(jìn)因子，與胚胎發(fā)生發(fā)育、組織再生修復(fù)以及腫瘤發(fā)生等過程有關(guān)。EGF通過與其受體EGFR結(jié)合激活下游信號(hào)通路而發(fā)揮作用。大量研究證明EGFR在多種腫瘤組織中有高表達(dá)，EGFR特異性阻斷劑在乳腺癌、

3、肺癌的靶向治療中療效顯著，但是否適用于其它類別腫瘤如肝癌的治療仍未有定論。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾ALC1可抑制MEK下游信號(hào)通路活性,提示ALC1與EGF/EGFR信號(hào)通路作用有重疊，但ALC1與EGFR之間是否存在關(guān)聯(lián)目前尚不清楚，本文擬對(duì)此進(jìn)行深入探討。
　　方法：
　　1、采用肝癌組織相鄰切片的免疫組織化學(xué)方法及免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)臨床肝癌標(biāo)本（肝癌及癌旁組織芯片）及肝癌細(xì)胞系A(chǔ)LC1與EGFR表達(dá)及定位；ALC1與

4、EGFR表達(dá)的相關(guān)性分析。
　　2、熒光實(shí)時(shí)定量PCR及Westernblot方法檢測(cè)EGF對(duì)肝癌BEL-7402和QGY-7703細(xì)胞ALC1表達(dá)的影響。
　　3、平板克隆、MTS、細(xì)胞劃痕及Transwell等實(shí)驗(yàn)觀察EGF/EGFR信號(hào)對(duì)ALC1促肝癌BEL-7402和QGY-7703細(xì)胞惡性表型作用的影響，探討EGF/EGFR信號(hào)與ALC1表達(dá)的關(guān)系。
　　4、用EGF處理ALC1敲減細(xì)胞株8024-shALC

5、1及其對(duì)照組8024-shCtr細(xì)胞,Westernblot方法檢測(cè)EGF對(duì)ALC1及EGF/EGFR下游信號(hào)分子MEK和ERK的影響；細(xì)胞生物學(xué)表型檢測(cè)驗(yàn)證EGF/EGFR對(duì)ALC1促肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性表型特征的介導(dǎo)作用。
　　結(jié)果：
　　1、肝癌組織芯片免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示ALC1陽性表達(dá)率為64.8%(35/54)，EGFR陽性表達(dá)率為70%(38/54)，ALC1和EGFR共表達(dá)率

6、為51.8%，兩者的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.662,P＜0.05）。免疫熒光雙標(biāo)記顯示肝癌BEL-7402和QGY-7703中有ALC1與EGFR的共表達(dá)。
　　2.肝癌SMMC-7721、Huh7、HepG2、BEL-7402、CRL-8024和QGY-7703細(xì)胞均有ALC1的表達(dá)；EGF處理30分鐘后BEL-7402和QGY-7703細(xì)胞即有ALC1表達(dá)增強(qiáng)；
　　3.當(dāng)用EGFR抑制劑Afatinib阻斷EGFR后給予

7、EGF處理，BEL-7402和QGY-7703細(xì)胞ALC1表達(dá)水平均明顯低于EGF處理組；MTS、平板克隆實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及EMT相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示EGF可明顯促進(jìn)BEL-7402和QGY-7703細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，促進(jìn)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)變化；阻斷EGFR后給予EGF對(duì)BEL-7402和QGY-7703細(xì)胞的增殖、遷移、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)等無明顯影響。
　　4.EGF處理ALC1敲減細(xì)胞株8024-shCtr/8024-AL

8、C1shRNA細(xì)胞，結(jié)果顯示ALC1表達(dá)水平與EGF/EGFR下游信號(hào)分子MEK和ERK的磷酸化程度有關(guān)；用EGF處理8024-ALC1shRNA細(xì)胞可明顯回調(diào)其ALC1表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲作用，與8024-shCtr組相比差別有顯著性意義（P＜0.05）。敲減ALC1所致的細(xì)胞表型特征改變?nèi)鏓-Cadherin高表達(dá)、N-Cadherin及Vimentin低表達(dá)可因EGF處理而回調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1、肝