柴胡皂甙-d逆轉人肝癌HepG2細胞惡性表型的研究.pdf

1、目的：
　　 以柴胡(Bupleurun Chinese DC,BCDC)為主要成分的中藥復方在肝癌的防治研究中顯示出良好的臨床應用前景。柴胡皂甙-d(Saikosaponin-d,SSd)是從柴胡中提取的主要活性成分,研究表明其具有抑制胃癌、肺癌細胞增殖的作用,但對肝癌細胞作用的研究報道甚少。本研究旨在探討SSd逆轉人肝癌HepG2細胞惡性表型的作用及其機制,為SSd在肝癌防治中的臨床應用提供理論依據。
　　 方法：<

2、br>　　 1.實驗分組
　　 常規(guī)培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞至對數生長期,接種96孔板,隨機分為五組:
　　 (1)實驗組:即SSd處理組,分別經2.5、5.0、10、20mg/L四組濃度SSd處理人肝癌HepG2細胞24、48和72h。四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法觀察SSd對人肝癌HepG2細胞增殖的影響,選擇其作用最明顯的劑量和時間作為后續(xù)實驗的處理因素。
　　 (2)對照組:用不含SSd的培養(yǎng)液處理He

3、pG2細胞與實驗組相同時間。
　　 2.實驗方法
　　 (1)MTT比色法觀察SSd對人肝癌HepG2細胞增殖的影響;
　　 (2)流式細胞術(Flow cytometry,FCM)檢測SSd對人肝癌HepG2細胞周期分布的影響;
　　 (3)倒置相差顯微鏡觀察SSd對人肝癌HepG2細胞形態(tài)學的影響;
　　 (4)化學發(fā)光法測定細胞上清液中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)濃

4、度;放免法檢測細胞上清液中白蛋白(Albumin,ALB)的濃度,觀察SSd對人肝癌HepG2細胞生化功能的影響;
　　 (5)通過transwell小室實驗觀察SSd對人肝癌HepG2細胞遷移的影響;(6)RT-PCR檢測人肝癌HepG2細胞p27基因mRNA表達的變化以探討SSd逆轉人肝癌HepG2細胞惡性表型的可能機制。
　　 結果：
　　 1.不同濃度的SSd處理HepG2細胞24、48、72h后,其抑制

5、率隨著作用時間的延長而逐漸增強:當SSd作用48h時,隨SSd濃度的增加其抑制作用也增強,以10mg/L的抑制率最高,與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。表現出一定的劑量-時間依賴性效應。
　　 2.10mg/L的SSd作用人肝癌HepG2細胞48h(實驗組),其細胞周期的分布發(fā)生明顯改變。實驗組:G1期:69.43±3.01、S期:22.3±0.82;對照組:G1期:62.83±2.72、S期:27.23±0.59。

6、兩組比較,差異均有統計學意義(P＜0.05)。3.10mg/L的SSd作用48h后,人肝癌HepG2細胞形態(tài)傾向于正常分化,細胞形態(tài)變小、變圓,核變小、變圓或卵圓形,核/漿比例縮小、核仁變少、變淡或不明顯(見第二部分圖3.1)。
　　 4.經10mg/L的SSd處理后,實驗組HepG2細胞上清液中ALB和AFP的含量發(fā)生明顯變化。實驗組:ALB:31.1±4.9mg/L、AFP.70.3±5.7mg/L:對照組:ALB:24.7

7、±2.8mg/L、AFP:118.2±15.6mg/L。兩組比較,差異均有統計學意義(P＜0.05)。
　　 5.經10mg/L的SSd處理后,實驗組人肝癌HepG2細胞的穿膜細胞數較對照組HepG2細胞明顯減少,兩組比較,差異有統計學意義(P＜0.01)。
　　 6.RT-PCR結果顯示:實驗組HepG2細胞p27基因mRNA的相對表達量為0.566、對照組HepG2細胞p27基因mRNA的相對表達量為0.335,兩者

8、之間差異有統計學意義(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.SSd具有抑制人肝癌HepG2細胞增殖的作用,在一定濃度范圍內,其作用具有濃度.時間依賴性效應;SSd可使HepG2細胞周期阻滯于G1期,此可能為SSd抑制人肝癌HepG2細胞增殖的重要途徑之一。
　　 2.SSd處理人肝癌HepG2細胞后,細胞向正常形態(tài)分化。與對照組比較,HepG2細胞培養(yǎng)液中AFP的濃度明顯降低、ALB升高、細胞遷移能力減弱,差