ALC1-CHD1L siRNA干擾對(duì)肝癌細(xì)胞MEK-ERK信號(hào)通路及干性特征的影響.pdf

1、背景與目的:多種腫瘤組織內(nèi)存在腫瘤干細(xì)胞（CSCs）,腫瘤的增殖、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥等都與CSCs密切相關(guān)；因此，以CSCs為治療靶標(biāo)可能是控制腫瘤發(fā)生發(fā)展的有效途徑。肝癌是世界上第5大惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿、放化療不敏感、術(shù)后5年存活率低。近年來(lái)的研究結(jié)果證明肝癌組織中存在CD133、CD90及OV6等陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞，表達(dá)干細(xì)胞自我更新相關(guān)分子如OCT4、 Sox2、Nanog等，具備CSCs生物學(xué)特征，有更強(qiáng)的致瘤性和抗化療能力。因此，深入

2、研究肝癌CSCs分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于臨床選擇特異性治療靶標(biāo)非常必要，是克服肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的希望所在。ALC1(amplified in liver cancer1)又名Chd1l(chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein1-like gene)，是從人肝癌細(xì)胞染色體1q21區(qū)分離并克隆出的癌基因，編碼89KDa的蛋白，含有保守的SNF2_N功能域、解旋酶功能域及Macro功能域，屬S

3、WI2/SNF2相關(guān)ATP酶超家族，與染色質(zhì)解鏈及DNA修復(fù)有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ALC1/CHD1L陽(yáng)性表達(dá)腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞樣特征：自我更新能力、高致瘤性、耐藥性及多分化潛能，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ALC1/CHD1L對(duì)胚胎植入前內(nèi)細(xì)胞群的發(fā)育不可或缺，提示ALC1/CHD1L可能與多能性調(diào)節(jié)有關(guān)，但ALC1/CHD1L與肝癌CSCs是否有關(guān)目前尚不清楚，本文擬對(duì)此進(jìn)行深入研究，并探討相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:
　　1．PCR檢測(cè)

4、肝癌細(xì)胞系CHD1L mRNA表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞系中CD133+細(xì)胞的百分比。
　　2．CD133免疫磁珠分選Huh7細(xì)胞，CD133-PE、OV6-FITC抗體對(duì)分選前后細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選前后Huh7細(xì)胞群內(nèi)CD133及OV6的表達(dá)率；細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)肝癌Huh7及HepG2細(xì)胞中ALC1/CHD1L和OV6的共表達(dá)率。
　　3．qRT-PCR檢測(cè)ALC1/CHD1L siRNA干擾對(duì)肝癌Hu

5、h7及HepG2細(xì)胞干性相關(guān)分子Oct4、Sox2、Nanog、Bmi1、β-catenin表達(dá)的影響；MTS實(shí)驗(yàn)及平板克隆實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ALC1/CHD1L siRNA干擾后對(duì)Huh7及HepG2細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4．RT-PCR方法檢測(cè)ALC1/CHD1L siRNA干擾對(duì)RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的影響;Western blot法從蛋白水平檢測(cè)ALC1/CHD1LsiRNA干擾后MEK/ERK通路相關(guān)蛋白及其磷酸化蛋白

6、、干性相關(guān)分子OCT4蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.肝癌細(xì)胞株Huh7、HepG2、SSMC-7721及BEL-7402均有CHD1L mRNA表達(dá)，其中Huh7和HepG2細(xì)胞CHD1L mRNA表達(dá)水平明顯高于SSMC-7721和BEL-7402。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示各株肝癌細(xì)胞中Huh7細(xì)胞CD133+細(xì)胞所占百分比最高，與其CHD1L mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　2.CD133磁珠分選前后Huh7細(xì)胞C

7、D133表達(dá)率分別為14.52％及73.3%，其中OV6表達(dá)率分別為4.95%及52.34%；細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肝癌 Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中ALC1/CHD1L與 OV6的共表達(dá)率為34.3%及48.34%。
　　3. siRNA干擾ALC1/CHD1L表達(dá)可引起Huh7及HepG2細(xì)胞Oct4、Sox2、Nanog、Bmi1、β-catenin等干性相關(guān)分子表達(dá)下降，與對(duì)照組相比差異均有顯著性意義。MTS實(shí)驗(yàn)

8、結(jié)果顯示ALC1/CHD1L siRNA干擾后Huh7及HepG2細(xì)胞增殖速度與對(duì)照組相比明顯下降；平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA干擾ALC1/CHD1L表達(dá)后Huh7及HepG2細(xì)胞克隆體積變小，克隆形成與對(duì)照組相比明顯減少，差異有顯著性。
　　4.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ALC1/CHD1LsiRNA干擾對(duì)MEK和ERK總蛋白水平無(wú)明顯影響，但p-MEK和p-ERK蛋白水平明顯下降；隨CHD1L表達(dá)下降干性相關(guān)分子

9、OCT4蛋白表達(dá)也明顯減少，與對(duì)照組相比差異有顯著性。
　　結(jié)論：
　　1.不同肝癌細(xì)胞株CHD1L表達(dá)水平有差別；肝癌細(xì)胞株CD133+陽(yáng)性細(xì)胞比率與其CHD1L表達(dá)水平趨勢(shì)一致；
　　2.肝癌Huh7及HepG2細(xì)胞中ALC1/CHD1L與干性標(biāo)記分子OV6共存；siRNA干擾 ALC1/CHD1L表達(dá)可顯著降低Huh7及HepG2細(xì)胞干性相關(guān)分子Oct4、Sox2、Nanog、Bmi1、β-catenin的表達(dá)；