PD98059對HL60細胞Ras-MEK1-2-ERK1-2信號轉(zhuǎn)導影響的研究.pdf

1、急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)亦稱急性髓細胞白血病(acute myelogenous leukenua，AML)M3型，約占成人AML的10％-15％。目前研究顯示，95％的APL患者細胞遺傳學有特異性t(15；17)(q22；q21)，導致15號染色體上PML基因(早幼粒白血病基因)和17號染色體上的RARα基因(維甲酸受體基因)形成PML-RARα融合基因，這是APL發(fā)病的

2、關鍵機制，但并非是唯一機制。近來研究表明PML-RARα轉(zhuǎn)基因小鼠同時發(fā)生FLT3(一種Ⅲ型酪氨酸蛋白激酶型受體)突變可以導致小鼠快速發(fā)生APL，提示Ras-MEK1/2(mitogen-activatedextracellularregulatedkinase1/2，絲裂原活化細胞外調(diào)節(jié)激酶)-ERK1/2(extracellularsignal-regulatedkinase1/2，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶)信號轉(zhuǎn)導途徑的異常在APL發(fā)生

3、中也起到重要作用。 Ras-MEK1/2-ERK1/2信號途徑是一個小GTP結(jié)合蛋白連接活化的受體酩氨酸激酶和胞漿蛋白激酶級聯(lián)反應，在多種腫瘤組織與細胞中檢測到該途徑的異?；罨D98059是一種MEK1特異性抑制劑，能夠特異性阻斷ERK1/2激酶MEK1對ERK1/2的磷酸化活化，導致G0/G1期阻滯，促進細胞凋亡。鑒于此，我們以急性早幼粒細胞白血病細胞株HL60為研究對象，探討PD98059對HL60細胞信號轉(zhuǎn)導的影響及其

4、作用機制，以期為白血病的基礎研究和臨床治療探尋一條新途徑。 目的： 探討MEK1抑制劑PD98059對急性早幼粒細胞白血病細胞株HL60細胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導以及細胞增殖的影響。 材料和方法： 一、細胞系 HL60細胞，由中國醫(yī)科大學遺傳實驗室惠贈 二、試劑PD98059購自Promega公司；RPMI1640購自GIBCO公司；胎牛血清購自中國醫(yī)學科學院工程研究所

5、；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、碘化丙錠(PI)均購自Sigma公司；M-MLV、DEPC處理水(RnaseFreeH2O)、Ribonucleaseinhibitor(HPR-I)、dNTP、ExTaq、DL2000DNAMarker、Oligod(T)Primer均購自TaKaRa公司；RT-PCR引物由TaKaRa公司合成。 三、試驗方法 1、細胞培養(yǎng) HL60細胞采用含10％胎牛血清的

6、RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：每48h換液一次。 2、MTT法測定HL60細胞生長的抑制情況收集對數(shù)生長期的HL60細胞，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12h，以6×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，然后加入100μl不同濃度的PD98059，使其終濃度在HL60細胞中依次為0、20、40、80μmol/L，培養(yǎng)24h、48h、72h；向每孔加入MTT溶液20μl，避光培養(yǎng)4h后，1000

7、rpm離心10min，棄上清，每孔加入DMSO150μl，震蕩均勻后酶標儀上測定490nm波長處吸光度(A)值。 3、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期對數(shù)生長期的HL60細胞，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12h，1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶，每瓶5ml，不同濃度的PD98059處理細胞，其終濃度分別為0、20、40μmol/L，培養(yǎng)24h、48h后，收集1×106個細胞至離心管，800rpm離心6min，4℃預冷PBS洗滌2次，4℃70％乙

8、醇固定過夜，4℃PBS洗滌2次，PI4℃避光染色30min，流式細胞術(shù)檢測凋亡、G0/G1期細胞的比率。 4、半定量RT-PCR法檢測ERK2、Skp2、p27基因表達水平對數(shù)生長期的HL60細胞，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12h，1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶，每瓶10ml，不同濃度的PD98059處理細胞，其終濃度分別為0、20、40、80μmol/L，培養(yǎng)48h后，收集細胞，Trizol液提取細胞總RNA，將RNA濃度調(diào)整為3mg/m

9、l，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入不同引物后進行PCR擴增，β-actin作為內(nèi)參，擴增產(chǎn)物經(jīng)10000×GeneFinder染色后2％瓊脂糖凝膠電泳，條帶經(jīng)紫外顯色光密度掃描，半定量檢測ERK2、Skp2、p27基因表達水平的改變。 四、統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)用-x±s表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS15.0進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果： 一、PD98059作用HL60細胞后細胞的生長情況PD98059對HL60細胞生長有抑

10、制作用，PD98059濃度為20μmol/L時，隨著作用時間的延長，其對HL60細胞的抑制作用增強，但48h較24h差異無統(tǒng)計學意義，PD98059濃度為40或80μmol/L時，隨著作用時間的延長抑制作用顯著增強(P＜0.05)；PD98059作用HL60細胞24h時，20μmol/L組較對照組差異無統(tǒng)計學意義，作用48h或72h，PD98059對HL60細胞的抑制作用存在劑量依賴，不同濃度組與對照組以及各濃度組之間差異顯著(P＜0.

11、05)。 二、PD98059對HL60細胞凋亡和細胞周期的影響20μmol/L的PD98059處理HL60細胞24h時即出現(xiàn)細胞凋亡，與對照組比較差異顯著，并且濃度相同時，隨著PD98059作用時間的延長凋亡增加，而作用時間相同時，隨著PD98059作用濃度的增加凋亡亦增加(P＜0.05)；PD98059作用HL60細胞24h時未發(fā)生明顯的G0/G1期阻滯，而48h后G0/G1期阻滯明顯增強(P＜0.05)。 三、PD9

12、8059對HL60細胞ERK2、Skp2、p27基因表達影響隨著PD98059濃度的增加，HL60細胞ERK2、Skp2基因表達水平下降，p27表達增加，差異具有顯著性(P＜0.05)。 討論： Ras-MEK1/2-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)是最近十幾年才開始研究的，與細胞的生長、增殖、分化等過程的調(diào)節(jié)以及腫瘤的發(fā)生有著密切的關系。 無論是正常細胞還是腫瘤細胞，Ras-MEK1/2-ERK1/2信號途徑均能促進細

13、胞由G0/G1期進入S期。研究發(fā)現(xiàn)，Ras-MEK1/2-ERK1/2信號途徑激活后既可以通過調(diào)節(jié)Bad、Mel-1、caspase9、Bcl-2等分子的表達來調(diào)控細胞的凋亡，亦可以調(diào)節(jié)細胞周期相關因子cyclinD1、CDK2、p21、p27等的表達，促進細胞從G0/G1期進入S期，從而調(diào)控細胞周期進程。 PD98059是一種MEK1特異性抑制劑，能夠阻斷MEK1對ERK1/2的磷酸化活化，阻礙細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至APL細胞及

14、其核內(nèi)，從而影響細胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物學效應。 ERK1/2的激活能夠調(diào)節(jié)白血病細胞的增殖和生存，研究顯示，在大多數(shù)初治AML患者中Ras-MEK1/2-ERK1/2系統(tǒng)被激活，并且與預后有關。Dong-OhMoon等發(fā)現(xiàn)PD98059能夠減少cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK4的表達，同時增加p21、p27、p16的表達，導致白血病U937細胞發(fā)生G1期阻滯，大劑量的PD98059能夠引起細胞凋亡。

15、在APL的發(fā)生發(fā)展中，Ras-MEK1/2-ERK1/2信號系統(tǒng)與CDKI家族的p21關系研究較透徹，而該途徑與p27之間的關系報道較少。 本實驗中將PD98059作用于白血病細胞系HL60細胞，可觀察到明顯的細胞生長抑制現(xiàn)象，結(jié)果顯示，隨著PD98059濃度增加或作用時間的延長，細胞的抑制率增加；PD98059能夠使HL60細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，誘導細胞凋亡，此作用具有劑量依賴性與時間依賴性，與文獻報道一致。 He

16、in Schepers等報道指出Ras-MEK1/2-ERK1/2信號途徑是通過增加Skp2(s-phase kinasea ssociated protein2，S-期相關蛋白2)的表達，促進p27的泛素化降解，從而促進白血病細胞增殖，說明Ras-MEK1/2-ERK1/2信號途徑能夠調(diào)節(jié)p27的蛋白表達；本實驗結(jié)果顯示PD98059作用于HL60細胞后，Ras-MEK1/2-ERK1/2通路阻滯，ERK2mRNA表達減少，同時其下游

17、分子Skp2的mRNA表達減少，p27的表達增加，說明Skp2作為Ras-MEK1/2-ERK1/2信號途徑的下游分子受其調(diào)控，進而調(diào)節(jié)p27的表達，調(diào)節(jié)細胞周期進程。 實驗中，我們觀察到，PD98059對HL60細胞增殖的抑制作用隨著濃度的升高而增強，表現(xiàn)出濃度依賴性。但是PD98059并不能完全抑制HL60細胞的增殖。即使80μmol/LPD98059作用48h，細胞抑制率也未能達到50％。說明在APL發(fā)病中，Ras-MEK

18、1/2-ERK1/2通路異常只是其中的一個發(fā)病機制，其他因素如染色體易位形成的基因異常(PML-RARα融合基因)也可能引起其它信號轉(zhuǎn)導的異常，應進一步研究從而揭示白血病發(fā)生發(fā)展的機制，以發(fā)現(xiàn)新的治療途徑。 結(jié)論： PD98059能夠抑制HL60細胞的生長，誘導細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，促進其凋亡，這可能是通過PD98059阻斷HL60細胞的Ras-MEK1/2-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導，影響了ERK2、Skp2、p27等的