ERK抑制劑PD98059對(duì)泡狀棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)的影響.pdf

1、目的：本研究以體外培養(yǎng)的泡狀棘球蚴原頭節(jié)為研究對(duì)象，將不同濃度的ERK抑制劑PD98059體外作用于泡狀棘球蚴原頭節(jié)，探討ERK抑制劑PD98059體外對(duì)泡狀棘球蚴原頭節(jié)的作用。
　　方法：麻醉已接種泡狀棘球蚴原頭節(jié)混懸液4-6個(gè)月的長(zhǎng)爪沙鼠，斷頸處死，在無(wú)菌條件下解剖，取出完整的泡狀棘球蚴組織團(tuán)塊，用PBS清洗組織塊3-5遍，研磨過(guò)濾，收集過(guò)濾液于無(wú)菌離心管中，靜置5分鐘，棄上清后用PBS洗滌原頭節(jié)多次至澄清，用生理鹽水制成泡狀

2、棘球蚴原頭節(jié)混懸液經(jīng)腹腔注射接種于倉(cāng)鼠以制備種鼠，培養(yǎng)4個(gè)月后在無(wú)菌條件下解剖，取組織塊經(jīng)勻漿器研磨，濾篩過(guò)濾收集原頭節(jié)，用含10％胎牛血清及雙抗（100U/mL青霉素，鏈霉素100U/mL）的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)，10d后，將不同濃度PD98059（0，6.25、12.5、25、50μmol/L）分別加入泡狀棘球蚴原頭節(jié)中進(jìn)行體外培養(yǎng)。每組加入泡狀棘球蚴原頭節(jié)約2000個(gè)。不同濃度PD98059作用不同時(shí)間，通過(guò)伊紅染色，在光鏡

3、下觀察原頭節(jié)的活力，計(jì)數(shù)并計(jì)算原頭節(jié)存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，繪制原頭節(jié)活力曲線；透射電子顯微鏡下觀察原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)改變；用Western blot檢測(cè)原頭節(jié)p-ERK蛋白表達(dá)水平；用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原頭節(jié)內(nèi)caspase-3酶活性;TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PD98059作用后原頭節(jié)體內(nèi)的凋亡狀況。
　　結(jié)果：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，DMSO對(duì)照組泡狀棘球蚴原頭節(jié)的活力變化不大，在第14天其活力為85±0.124%，而將

4、不同濃度PD98059作用于泡狀棘球蚴原頭節(jié)6d后，通過(guò)伊紅染色方法測(cè)得6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L組泡狀棘球蚴原頭節(jié)的活力分別為53.93±0.082%、51.69±0.297%、38.18±0.254%、28.21±0.241%；連續(xù)觀察，在第14d，6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L PD98059組泡狀棘球蚴原頭節(jié)的活力分別僅為25.48±0.271%、

5、20.1±0.092%、12.17±0.197%，50μmol/LPD98059組殺傷作用最為明顯，泡狀棘球蚴原頭節(jié)的活力為0.53±0.012%。由此證實(shí)隨著PD98059作用時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加，PD98059對(duì)原頭節(jié)的生長(zhǎng)抑制作用越明顯,具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性。透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，DMSO組泡狀棘球蚴原頭節(jié)合胞體帶結(jié)構(gòu)相對(duì)較致密，其內(nèi)囊泡排列較規(guī)則，合胞體帶向外長(zhǎng)有微毛，排列整齊，微毛外側(cè)有較厚的糖衣，原頭節(jié)內(nèi)含有多種

6、不同類型的細(xì)胞，實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核大而明顯，核仁居于中央，核內(nèi)異染色質(zhì)較少；而不同濃度PD98059作用后泡狀棘球蚴原頭節(jié)體被合胞體帶變薄，囊泡擴(kuò)張，出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，微毛缺損甚至消失；一部分實(shí)質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)濃縮，核仁消失，核異染色質(zhì)增多，細(xì)胞減少，且出現(xiàn)許多空泡及脂滴。Western bolt檢測(cè)顯示，6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L PD98059作用于泡狀棘球蚴原頭節(jié)1d和3d后，均可降低泡狀棘

7、球蚴原頭節(jié)p-ERK蛋白表達(dá)水平。Caspase-3活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與DMSO對(duì)照組相比，不同濃度 PD98059作用于泡狀棘球蚴原頭節(jié)1d和2d后均可增加原頭節(jié)的caspase-3酶活性。TUNEL試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，25μmol/L、50μmol/L PD98059作用于泡狀棘球蚴原頭節(jié)24h后可促使泡狀棘球蚴原頭節(jié)發(fā)生凋亡。
　　結(jié)論：ERK抑制劑PD98059在體外可明顯抑制泡狀棘球蚴原頭節(jié)的生長(zhǎng)，有望成為一種新型的抗包蟲(chóng)藥物。