從Ras-Raf--MEK1-2-ERK1-2信號通路探討電針干預膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的機制.pdf

1、目的：
　　基于Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信號通路，探討電針干預骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的機制。
　　方法：
　　1.2月齡SPF級SD雄性大鼠40只，隨機分為4組，即假手術(shù)組:假手術(shù)后正常飼養(yǎng)，不做任何干預;造模組:造模后正常飼養(yǎng)，不做任何干預;實驗1組:造模后，電針治療15 min/day;實驗2組:造模后，電針治療30 min/day。每兩周各組稱重，記錄體重變化。制備動脈血清、膝關(guān)節(jié)滑膜、股骨髁軟骨樣品

2、。HE染色和甲苯胺藍染色觀察股骨髁軟骨表面形態(tài)學變化;Elisa檢測滑膜組織IL-1β表達變化;Western-blot檢測關(guān)節(jié)軟骨ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13、Ras、Raf、 MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2、c-fos、c-jun及c-myc蛋白表達變化。
　　2.4周齡SPF級SD雄性大鼠10只，運用機械-酶消化法獲取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞，體外原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，采用倒置相差顯微鏡

3、觀察各代軟骨細胞的內(nèi)外形態(tài)結(jié)構(gòu)，甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色對體外軟骨細胞進行鑒定。采用不同濃度脂多糖分別干預體外軟骨細胞，Elisa法檢測篩選脂多糖較佳作用濃度及時間，建立體外軟骨細胞炎癥模型。脂多糖和各組含血清培養(yǎng)液（空白血清組、模型組、U0126組、電針15min組、電針30min組）分別干預軟骨細胞，激光共聚焦觀察軟骨細胞CollagenⅡ、ADAMTS-4蛋白表達變化;Westem-blot檢測軟骨細胞Ras、Raf、M

4、EK、ERK1/2、p-ERK1/2、c-fos、c-jun及c-myc蛋白表達變化;q-PCR檢測軟骨細胞miR-34a、miR-146a及miR-27b基因表達變化。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠的平均體重，造模組顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，實驗1組和實驗2組顯著低于造模組(P＜0.01)，實驗1組、實驗2組與假手術(shù)組無明顯差異(P＞0.05);膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1β的表達，造模組顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，實

5、驗1組和實驗2組顯著低于造模組(P＜0.01);軟骨組織ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13、Ras、Raf、MEK、p-ERK1/2、c-fos、c-jun及c-myc蛋白的表達，造模組顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，實驗1組和實驗2組顯著低于造模組(P＜0.01，P＜0.05)。
　　2.脂多糖誘導體外軟骨細胞炎癥模型的較佳作用濃度為10 ng/ml，干預時間為8h;軟骨細胞上清液MMP-3、MMP-

6、9及MMP-13的表達，模型組顯著高于空白血清組(P＜0.01或P＜0.05)，電針15 min組、電針30 min組及U0126組顯著低于模型組(P＜0.01或P＜0.05);軟骨細胞Ras、Raf、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、c-fos、c-jun、c-myc及ADAMTS-4蛋白的表達，模型組顯著高于空白血清組(P＜0.01)，電針15min組、電針30min組及U0126組顯著低于造模組(P＜0.01);軟骨細胞Co

7、llagenⅡ蛋白的表達，模型組顯著低于空白血清組，電針15min組、電針30min組及U0126組顯著高于模型組;軟骨細胞miR-34a及miR-146a基因的表達，模型組顯著高于空白血清組(P＜0.05)，電針15 min組、電針30min組及U0126組顯著低于模型組(P＜0.05);miR-27b基因的表達，模型組顯著低于空白血清組(P＜0.05)，電針15min組、電針30min組及U0126組顯著高于模型組(P＜0.05)。