電針對兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨MMP-9及TIMP-1表達的影響.pdf

1、目的:骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種運動系統(tǒng)的慢性退行性疾病,其病因及發(fā)病機制十分復(fù)雜,是力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用引起關(guān)節(jié)軟骨細胞、細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)以及軟骨下骨三者合成與降解的正常偶聯(lián)失去原有平衡的結(jié)果。其中,引起OA關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性變的一個重要原因在于關(guān)節(jié)軟骨ECM合成與降解之間的內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs

2、)是參與關(guān)節(jié)軟骨ECM和基底膜降解過程的所有酶中最重要的一種,其發(fā)揮酶類作用的特異性抑制物是金屬蛋白酶組織抑制劑(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMPs),ECM內(nèi)環(huán)境維持主要依賴于MMPs/TIMPs的動態(tài)平衡,二者在OA軟骨發(fā)生退行性變過程中都起著非常重要的作用。電針通過毫針刺激將低頻脈沖微電流傳入相應(yīng)穴位,使皮膚、肌肉、關(guān)節(jié)囊、韌帶等本體感受器受到刺激后使大量的本體運動和皮膚感覺的信息傳入

3、中樞,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)肌張力、緩解痙攣、通絡(luò)止痛等作用,是一種對早、中期OA有效的非藥物治療方法,但目前仍以臨床研究為主,機制方面的研究甚少。本課題通過HE染色、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測電針治療前后兔膝骨關(guān)節(jié)炎(kneeosteoarthritis,KOA)關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)、軟骨細胞病理改變情況以及軟骨組織中MMP-9和TIMP-1表達含量的變化進行觀測,探討電針在細胞、分子水平上治療KOA的作用機制,為今后的實驗研究打下堅實的基礎(chǔ),也為臨床工

4、作提供一定的理論依據(jù)。
　　方法:(1)對象和干預(yù)措施:選取健康新西蘭大耳兔30只,按照隨機數(shù)字表法分為三組,即正常組、模型組和電針干預(yù)組。正常組常規(guī)喂養(yǎng)不實施任何干預(yù)措施,其余兩組兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)進行伸直位管型石膏固定,構(gòu)建OA模型。喂養(yǎng)6周后,用5ml空針向兔耳緣靜脈注入適量空氣處死正常組與模型組,切開暴露左側(cè)膝關(guān)節(jié),取內(nèi)側(cè)髁軟骨,對造模后的相關(guān)指標變化情況進行觀察。同時,電針干預(yù)組取造模關(guān)節(jié)附近“梁丘”、“足三里”、“血?！?、“

5、陽陵泉”四個臨床常用穴位,用30號一寸毫針針刺,接著將G9805-C型低頻電子脈沖治療儀與針柄相連,調(diào)至疏、密波交替模式,頻率分別選擇4Hz、20Hz,脈沖寬度0.5ms,20min/次,1次/日,干預(yù)10次后用與模型組相同的方法處死電針干預(yù)組,取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髁軟骨觀測其各方面的變化情況。(2)觀察指標:①三組兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)均通過肉眼大體觀察形態(tài)改變情況;②切取左膝股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨,置于40g/L多聚甲醛固定液內(nèi),10％EDTA脫鈣液脫鈣

6、后,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色,光鏡下觀察軟骨細胞形態(tài)、潮線完整性等,按彭太平組織病理結(jié)構(gòu)分級和Mankin’s評分標準分別對觀察結(jié)果進行分級、評分。③免疫組織化學(xué)檢測:用兔抗MMP-9及TIMP-1試劑分別進行相關(guān)實驗,測二者在正常組、模型組和電針干預(yù)組兔左膝股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨的表達情況。(3)統(tǒng)計學(xué)方法:用SPSS15.0軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,對數(shù)據(jù)進行處理分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　

7、結(jié)果:(1)軟骨結(jié)構(gòu)大體觀察:正常組兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)無明顯關(guān)節(jié)積液,通過大體觀察發(fā)現(xiàn)軟骨表面平整,呈藍白色且泛亮光,無裂紋,關(guān)節(jié)面及滑膜為I級,軟骨結(jié)構(gòu)Mankin’s評分為0分。模型組經(jīng)伸直位管型石膏固定6周后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)幾乎均可見有積液,關(guān)節(jié)面不光滑且略欠平整,少數(shù)部位可見糜爛,外觀均較灰暗,顏色偏黃,光澤度較正常組差,關(guān)節(jié)面及滑膜為III級;電針干預(yù)組部分造模關(guān)節(jié)可見關(guān)節(jié)腔積液,滑膜增生,光澤度與正常組相比仍有差異,未見明顯糜爛,軟骨表

8、面不光滑,欠平整,與模型組相比已有所改善;根據(jù)Mankin’s評分標準比較模型組及電針干預(yù)組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(2)HE染色病理學(xué)觀察:正常組兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨表面平整,軟骨層厚度基本一致,軟骨細胞大小接近,排列規(guī)則,深層細胞、中間層細胞、表層細胞分別呈柱形、圓形、梭形,中間層分布較散,表層接近平行排列,潮線完整,Mankin’s評分記為0分;模型組染色結(jié)果顯示軟骨表層有小裂隙,軟骨層厚度與正常組相比明顯變薄

9、,軟骨細胞數(shù)量下降,細胞排列無規(guī)則,局部呈現(xiàn)大量簇聚,潮線紊亂,Mankin’s評分較正常組增加(P<0.05),電針干預(yù)組軟骨表面較規(guī)則,裂隙少,成簇少見,軟骨細胞排列整齊,Mankin’s評分較模型組減小(P<0.05),但與正常組比較,軟骨細胞數(shù)較模型組明顯增多,軟骨層厚度較模型組增加,可見潮線紊亂,Mankin’s評分增加(P<0.05)。(3)免疫組化MMP-9及TIMP-1測定:正常組關(guān)節(jié)軟骨細胞胞漿中偶見淺棕黃色MMP-9

10、及TIMP-1弱陽性染色;模型組大量軟骨細胞中可見棕色MMP-9強陽性染色顆粒,尤以深層密度最高,成熟軟骨細胞中較多,為深棕褐色顆粒,少量細胞可見棕黃色TIMP-1陽性染色;電針干預(yù)組部分軟骨細胞中可見棕黃色MMP-9陽性染色,以及大量深棕色TIMP-1強陽性染色顆粒。電針干預(yù)組MMP-9表達量較模型組減少,與正常組比表達量增加(P<0.05),電針干預(yù)組TIMP-1表達量較模型組增加,與正常組比呈高表達(P<0.05)。
　　結(jié)

11、論:(1)本實驗采用石膏對兔膝關(guān)節(jié)進行伸直位機械性制動6周可成功復(fù)制OA模型。(2)MMP-9與TIMP-1的基礎(chǔ)分泌量對維持關(guān)節(jié)軟骨的完整性至關(guān)重要,如果MMP-9/TIMP-1二者之間失衡會造成與關(guān)節(jié)軟骨相應(yīng)的ECM過度降解,從而促進關(guān)節(jié)軟骨退變。(3)電針能減緩?fù)肒OA關(guān)節(jié)軟骨退變,促進關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù),其作用機制可能與減少軟骨中MMP-9含量、增加TIMP-1含量有關(guān),有效調(diào)整了MMPs/TIMPs二者的平衡,抑制了ECM的