電針對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中β-catenin表達的影響.pdf

1、目的:骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是中老年人群中常見的一種骨關(guān)節(jié)疾病，OA的主要病理改變發(fā)生于關(guān)節(jié)軟骨，其可導致關(guān)節(jié)軟骨從變性到破壞到最終的骨贅形成的進行性改變，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的觀點認為OA發(fā)病與IL-1、IL-6、TNF-α等促炎因子以及MMP-1、MMP-3，MMP-9等蛋白酶類的產(chǎn)生過多有關(guān)，然而相關(guān)基因敲除的小鼠動物實驗并沒有為此提供有力證據(jù)，在臨床治療中，應用抗炎藥物及蛋白酶類抑制劑也沒有取得好

2、的療效。因此，OA的發(fā)病機制還需要進一步闡明。近年來有學者研究表明Wnt/β-catenin信號通路在OA的發(fā)病過程中起著重要的作用。已有動物實驗表明:特異性增加小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞中β-catenin表達，在小鼠成年后，其膝關(guān)節(jié)可以出現(xiàn)OA樣改變，揭示上調(diào)的Wnt/β-catenin信號通路可能與動物OA的發(fā)生有關(guān)。OA的治療可以分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療，其中電針治療是臨床上常用的一種非手術(shù)治療方法。電針治療將傳統(tǒng)的針灸與電刺激結(jié)合起來

3、，針灸可刺激OA患者穴位，促進機體釋放鎮(zhèn)痛物質(zhì)，而電刺激能使肌肉收縮，改善局部血液循環(huán)，有利于損傷的修復。因此，本實驗應用電針治療膝OA的動物模型，通過肉眼和HE染色觀察關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)變化和軟骨細胞病理改變、免疫組化方法比較治療前后軟骨細胞中β-catenin表達變化，擬從細胞和分子水平上初步探討電針治療兔膝OA動物模型的作用機制。
　　方法:(1)材料和干預措施:健康新西蘭大白兔36只（雌雄不限），隨機分為三組，正常對照組12只，

4、不作任何處理，模型組和電針治療組各12只參照Videman法將左后肢膝關(guān)節(jié)于伸直位用石膏固定以建立OA模型。電針治療組在造模6w后，患膝關(guān)節(jié)行電針治療，選取兔左下肢足三里、梁丘、內(nèi)膝眼、外膝眼四個穴位，每天同—時間治療25min，持續(xù)治療15d，其余兩組于每天相同時間固定25min。15d后空氣栓塞法處死三組動物，打開左膝關(guān)節(jié)進行大體觀察，再以銳利刀片切取股骨內(nèi)髁內(nèi)側(cè)帶軟骨下骨質(zhì)的軟骨標本，使其呈約0.5cm×0.5cm×0.5cm全軟

5、骨組織塊，制作切片后行HE染色、免疫組化檢測及光鏡觀察。按改良的Mankin's評分標準為切片評分，將所得評分及檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。(2)觀察指標:①肉眼觀察三組兔左膝關(guān)節(jié)大體形態(tài)變化，并進行關(guān)節(jié)軟骨的改良Mankin's評分;②切取少許兔左膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨后于10％中性甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片，并作HE染色后，在光鏡下觀察軟骨細胞形態(tài)的變化，并按照改良的Mankin's評分標準對各組的軟骨細胞進行評分。③免疫組織化學分析:

6、用β-catenin免疫組化試劑盒檢測各組實驗兔關(guān)節(jié)軟骨細胞中β-catenin的表達情況，并在光鏡下用形態(tài)計量學方法計算β-catenin細胞分數(shù)。(3)統(tǒng)計學處理:統(tǒng)計學分析軟件采用IBM SPSS Statistics19.0。所得計量數(shù)值采用(x)±s表示，P＜0.05為差異具有顯著性，P＜0.01為具有顯著性差異。
　　結(jié)果:(1)各組膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察:正常對照組，左膝關(guān)節(jié)內(nèi)未見明顯關(guān)節(jié)腔積液，股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨外觀表面光

7、滑，呈藍白色、明亮且無明顯裂紋;按改良Mankin's評分標準，各組軟骨的軟骨結(jié)構(gòu)評分0分。模型組12只兔軟骨光澤度和透明度降低，色淡黃，部分軟骨表面有小的裂隙及異常突起，關(guān)節(jié)面較粗糙，大部分關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見明顯積液。軟骨結(jié)構(gòu)按改良的Mankin's評分結(jié)果3只為2分，6只為3分，3只為4分。電針治療組僅4只可見關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液，且量較模型組少，部分軟骨表面有少許潰瘍，軟骨表面光滑，光澤度較正常對照組差但優(yōu)于模型組，軟骨結(jié)構(gòu)改良Mankin's

8、評分3只為1分，5只為2分，4只為3分。將各組的改良Mankin's軟骨結(jié)構(gòu)評分結(jié)果進行統(tǒng)計學比較，具有顯著性差異（P＜0.01）。(2)軟骨細胞HE染色病理學觀察:正常對照組，HE染色示軟骨表面平整光滑，軟骨層厚薄均勻，基質(zhì)著染均勻，軟骨細胞大小一致、整齊排列且潮線十分完整，按改良的Mankin's評分標準對軟骨細胞及潮線完整性進行評分，得分均為0分。模型組染色顯示關(guān)節(jié)軟骨表層出現(xiàn)潰爛、缺失，且軟骨厚度變薄、層數(shù)減少，軟骨細胞成團聚集

9、，形狀不規(guī)則，潮線紊亂。軟骨細胞改良Mankin's評分5只2分，7只3分，潮線評分4只1分，8只2分，兩項評分均較正常組增加（P＜0.01）。電針治療組染色顯示軟骨層較正常組變薄，但較模型組厚，軟骨表面較模型組光滑，少部分有小的裂隙形成，但裂隙局限在軟骨表層，軟骨細胞較飽滿，形態(tài)規(guī)則，小部分軟骨切片偶見少數(shù)軟骨細胞聚集，潮線較正常組紊亂，軟骨細胞改良Mankin's評分6只1分，6只2分，潮線評分1只2分，其余均為1分。兩項評分均較模

10、型組減少（P＜0.01）。(3)軟骨免疫組化β-catenin檢測結(jié)果:在顯微鏡下，軟骨細胞內(nèi)的黃褐色顆粒即為β-catenin的陽性表達。正常組β-catenin呈弱陽性表達，本次實驗鏡下極少見黃褐色顆粒;模型組β-catenin呈強陽性表達，全層軟骨可見深黃褐色顆粒。電針治療組β-catenin表達較模型組降低，鏡下僅在表層和部分中層軟骨發(fā)現(xiàn)少許淺黃褐色顆粒。
　　結(jié)論:(1)采用膝關(guān)節(jié)伸直位管形石膏制動6周能較好的模擬膝OA