電針對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨SIRT1和p53表達的影響.pdf

1、目的:骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)軟骨退行性病變?yōu)橹鳎瑫r合并骨刺形成、滑膜改變等綜合病變的慢性疾病，患病率隨著人口老齡化、肥胖率的增加而增加。軟骨細胞衰老和凋亡已被證實與OA的形成和發(fā)展密切相關(guān)。沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(Silent information regulator2 homolog protein1，SIRT1)與細胞衰老密切相關(guān)，并在人類軟骨細胞以及軟骨組織中具有一定程度表達，O

2、A患者軟骨細胞SIRT1表達明顯低于正常關(guān)節(jié)軟骨細胞。p53腫瘤抑制基因(p53 tumor suppressor gene，p53)又名基因管家，控制著細胞周期的啟動，決定細胞是否開始分裂，并控制細胞的凋亡，其在關(guān)節(jié)軟骨中的表達與OA進程密切相關(guān)。SIRT1不僅可通過與p53相互作用來調(diào)控細胞凋亡，還可通過調(diào)控核因子-κB來影響細胞凋亡，抑制過氧化物酶增殖活化受體、調(diào)控FOXO轉(zhuǎn)錄因子來延長細胞壽命以及其他途徑共同作用來調(diào)控細胞凋亡和

3、衰老。電針作為傳統(tǒng)中醫(yī)療法與現(xiàn)代物理因子治療結(jié)合的產(chǎn)物，其對OA的療效已被越來越多的臨床所證實。本實驗采用兔伸膝位制動建立膝OA動物模型，通過觀察電針治療后兔膝關(guān)節(jié)軟骨光鏡下HE染色的形態(tài)學(xué)改變，并將免疫組化法所測得的關(guān)節(jié)軟骨SIRT1和p53表達數(shù)值與正常對照組和模型組進行對比，以期從細胞以及分子水平探討電針治療膝OA的可能作用機制。方法:(1)對象及干預(yù)措施:從瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心采購健康新西蘭大耳兔39只，采用隨機數(shù)字表法隨機抽

4、取13只作為正常對照組，不制造膝OA模型，余26只隨機平均分為模型組和電針治療組。對模型組和電針治療組的實驗兔均采取管形石膏伸膝位固定法固定6周以建立膝OA模型。造模6周后，采用隨機數(shù)字表法從模型組和電針治療組各選取一只實驗兔處死，觀察其左膝關(guān)節(jié)相應(yīng)的指標變化，以確定造模是否成功。電針治療組予以電針干預(yù)治療。實驗結(jié)束時，處死全部實驗兔，切開兔左膝關(guān)節(jié)并取部分股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨制作標本，觀察各組相關(guān)指標變化情況。(2)觀察指標:①采用肉眼

5、觀察法觀察各組兔左膝關(guān)節(jié)內(nèi)部大體形態(tài)變化;②切取少許兔左膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨作HE染色，光鏡下觀察軟骨細胞形態(tài)、軟骨膠原及蛋白多糖等基質(zhì)含量改變的情況，分別對軟骨大體形態(tài)情況及光鏡觀察結(jié)果按改良Mankin's評分標準進行評分;③免疫組織化學(xué)定量分析:采用兔抗SIRT1試劑盒和p53試劑盒檢測兔左膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨SIRT1和p53的表達情況。(3)統(tǒng)計學(xué)處理:統(tǒng)計學(xué)分析采用IBM SPSS Statistics19.0軟件進行，所得

6、計量數(shù)值采用(x)±s表示，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為顯著統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:(1)膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察:正常對照組，未見明顯關(guān)節(jié)腔積液，軟骨外觀表面光滑，呈藍白色，明亮且無明顯裂紋;模型組，大部分關(guān)節(jié)腔積液明顯，軟骨偏暗黃，部分呈米黃色，失去原有光澤，其表面粗糙，可見明顯裂紋、裂隙、糜爛及潰瘍形成，部分關(guān)節(jié)負重區(qū)，軟骨可見全層缺損，軟骨下方骨暴露，有骨贅新生物形成;電針治療組大部分動物軟骨表面不平整，稍淡黃色，散在分布點

7、狀充血，偶見糜爛，關(guān)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液及滑膜增生，關(guān)節(jié)積液程度較模型組輕。將電針治療組與模型組的關(guān)節(jié)面及滑膜按彭太平法組織病理學(xué)分級后進行秩和檢驗兩兩比較，肉眼觀察結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而光鏡下差異不明顯。按改良Mankin's評分將電針治療組與模型組軟骨結(jié)構(gòu)比較，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。(2) HE染色病理學(xué)觀察:正常對照組，HE染色示軟骨表面平整光滑，軟骨層厚薄均勻，基質(zhì)著染均勻，軟骨細胞大小一致、整齊排列且

8、潮線十分完整;模型組，HE染色示軟骨表層出現(xiàn)潰爛、缺失，其軟骨層厚度明顯變薄，染色明顯減退，軟骨細胞數(shù)量大量減少，可見到形狀不規(guī)則的大胞體軟骨細胞大量簇聚，潮線十分紊亂;電針治療組，關(guān)節(jié)軟骨表面比較規(guī)則，偶見較小的裂隙，軟骨細胞排列也較整齊，細胞數(shù)明顯增多，偶見部分軟骨細胞破裂，軟骨層厚度明顯增加，細胞染色輕度減退，可見潮線輕度紊亂。將病理切片整體HE染色按改良Mankin's評分進行比較，模型組和電針治療組比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜

9、0.01)。將正常對照組、電針治療組與模型組的軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細胞、潮線完整性及HE染色按改良Mankin's評分進行比較，均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。(3)免疫組化染色觀察:正常對照組光鏡下，SIRT1的表達見軟骨細胞核大量濃黃褐色著色，數(shù)量多。而p53的表達雖軟骨細胞多但只有少量細胞核黃褐色著色;模型組光鏡下，SIRT1的表達見關(guān)節(jié)軟骨細胞核少量淺黃褐色著色。而p53的表達見軟骨細胞數(shù)量雖少但大部分細胞黃褐色濃染，細胞核著色

10、均勻;電針治療組光鏡下，SIRT1的表達見大量細胞核黃褐色著色，數(shù)量較正常對照組稍少，染色較深。而p53的表達見軟骨細胞核少量黃褐色染色，數(shù)量較正常對照組稍多。將正常對照組、電針治療組與模型組關(guān)節(jié)軟骨按免疫組化法測得的SIRT1和p53表達數(shù)值進行比較，均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。將正常對照組、電針治療組與模型組的SIRT1和p53進行相關(guān)性分析，各組均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，即在正常人群和骨關(guān)節(jié)炎患者中的SIRT