CRKL與肝癌臨床相關(guān)性及其與ETV6--miR--429形成調(diào)控環(huán)路影響肝癌細(xì)胞體外惡性表型的研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(HCC)是肝癌中的一種常見的類型，其發(fā)病率及死亡率在全球常見惡性腫瘤中均位于前列。通常肝細(xì)胞癌患者被確診時(shí)已經(jīng)處于癌癥晚期，錯(cuò)過了通過手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，目前探究肝細(xì)胞癌的早期診斷方法仍是一個(gè)急需解決的問題。因此研究肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子水平變化及調(diào)控機(jī)制，為肝癌的診斷提供靶點(diǎn)，具有極其重要的意義。
　　CRK最初發(fā)現(xiàn)于禽類肉瘤病毒CT10(chicken tumor10)中，作為一種癌基因其由SH2和SH3結(jié)構(gòu)域組成

2、。CRK家族包括三個(gè)成員:CRKⅠ、CRKⅡ和CRKL這三個(gè)分子在人體的各個(gè)組織中都具有表達(dá)的情況。最近幾年的研究情況表明:CRKL與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，CRKL主要通過參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，參與組織癌變過程等。但CRKL在人肝細(xì)胞癌中的功能及與其他分子之間的調(diào)控機(jī)制尚無研究。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守的包含18-24個(gè)堿基的單鏈非編碼RNA。miRNAs能夠特異性結(jié)合靶基因mRNA的3’-

3、UTR區(qū)導(dǎo)致靶基因mRNA降解或抑制靶基因的翻譯。前期我們?cè)谏镄畔W(xué)軟件上發(fā)現(xiàn)miR-429與CRKL存在靶向關(guān)系，但二者在肝細(xì)胞癌中的相關(guān)性研究未見報(bào)道。
　　ETV6又稱TEL，是轉(zhuǎn)錄因子ETS家族中的一員，一直被認(rèn)為是造血干細(xì)胞的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)其能潛在與miR-429的DNA啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，可能進(jìn)一步調(diào)控miR-429的轉(zhuǎn)錄。ETV6與miR-429的關(guān)系及其進(jìn)一步對(duì)CRKL的調(diào)控作用無人研究。

4、>　　目的:1.CRKL表達(dá)水平與肝癌臨床相關(guān)性的探究;2.CRKL水平變化對(duì)肝癌惡性表型的調(diào)控探究;3建立CRKL與miR-429和ETV6的相互調(diào)控關(guān)系。
　　方法:1.WB和IHC的方法檢測(cè)肝癌臨床樣本和肝癌細(xì)胞中CRKL蛋白表達(dá)水平檢測(cè);2.慢病毒感染法構(gòu)建CRKL過表達(dá)的肝癌細(xì)胞株;3.MTT法檢測(cè)CRKL過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞體外增殖影響;4.Transwell法檢測(cè)CRKL過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞體外遷移和侵襲影響;5.通過倒置熒

5、光顯微鏡觀察CRKL過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞顯微形態(tài)的影響;6鬼筆環(huán)肽染色法檢測(cè)CRKL過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞骨架影響;7WB和qRT-PCR法檢測(cè)CRKL水平變化肝癌細(xì)胞株中ETV6和miR-429水平影響8.WB和qRT-PCR法檢測(cè)miR-429和CRKL在ETV6敲低肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平的變化9.雙熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)探究miR-429與CRKL靶向關(guān)系;10.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究CRKL與ETV6結(jié)合;11.染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究ETV6與miR-

6、429啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。
　　結(jié)果:1.30例肝癌臨床樣本和48例肝癌組織芯片分析結(jié)果表明:CRKL在肝癌患者組織中高表達(dá);2.CRKL在肝癌細(xì)胞中比在正常肝細(xì)胞中表達(dá)量高;3.獲得HepG2、HCCLM3和HuH7的CRKL穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株，過表達(dá)效率分別為310％、180％和80％;4.CRKL過表達(dá)提高肝癌細(xì)胞體外增殖能力;5.CRKL過表達(dá)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞體外遷移侵襲能力;6.CRKL過表達(dá)能夠影響肝癌細(xì)胞的顯微形態(tài)并且促進(jìn)細(xì)胞

7、骨架的形成;7.在肝癌細(xì)胞中ETV6與CRKL表達(dá)水平正相關(guān)，miR-429與CRKL表達(dá)水平負(fù)相關(guān);8.ETV6下調(diào)后miR-429靶向CRKL的水平降低，從而降低CRKL在肝癌細(xì)胞中的表達(dá);9.CRKL通過與ETV6結(jié)合增強(qiáng)ETV6表達(dá)水平;11.ETV6與miR-429啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合來發(fā)揮作用。
　　結(jié)論:1.CRKL在肝癌樣本中高表達(dá);2.CRKL在人肝癌細(xì)胞中高表達(dá);3.CRKL過表達(dá)能夠提高肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力