CrkL下調(diào)對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞Hca-P生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景:惡性腫瘤的早期淋巴道轉(zhuǎn)移致患者死亡率高、預(yù)后差，其發(fā)生機(jī)制一直是腫瘤學(xué)的研究難題。小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F和Hca-P具有相同遺傳背景，它們來自同一小鼠腹水肝癌細(xì)胞克隆的不同亞克隆，且Hca-F為高淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約75％），Hca-P為低淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約25％），是研究腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的理想細(xì)胞模型。
　　Crk最初作為一種癌基因產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)于禽類肉瘤病毒CT10(chicken tumor10)中，

2、主要由SH2(src homology2)和SH3結(jié)構(gòu)域組成。Crk家族包括三個(gè)成員:CrkⅠ、CrkⅡ和CrkL，在各種組織中廣泛表達(dá)。信號(hào)接頭蛋白CrkL(Crk-Like)是Crk家族成員之一，近年來研究表明:CrkL異常表達(dá)與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)，但CrkL與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系鮮有報(bào)道。
　　本研究組前期通過Western blot發(fā)現(xiàn)，CrkL在小鼠高、低淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞株Hca-F和Hca-P中表達(dá)差異顯著，其在H

3、ca-P中的表達(dá)是Hca-F中的3.05倍(P＜0.05)，提示CrkL的表達(dá)水平與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能是潛在的抑制肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)分子。本研究通過RNA干擾技術(shù)，下調(diào)CrkL在Hca-P中的表達(dá)，進(jìn)一步探索CrkL對(duì)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　目的:1、構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL表達(dá)載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌低淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞Hca-P中，獲得CrkL表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的Hca-P細(xì)胞

4、株;2、研究CrkL下調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響;3、研究CrkL下調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞致鼠成瘤性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的影響。
　　方法:1、依據(jù)CrkL的mRNA序列(GenBank:BC131984)，利用siDirect和whitehead軟件設(shè)計(jì)針對(duì)CrkL的siRNA，同時(shí)設(shè)計(jì)無關(guān)序列作為陰性對(duì)照。利用Lipofectamine2000介導(dǎo)法，將構(gòu)建好的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL表達(dá)載體

5、及pGPU6/GFP/Neo-shRNA-control無關(guān)序列表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至Hca-P細(xì)胞中，24 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)400μg/ml G418篩選及有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hca-P單克隆細(xì)胞株。采用Western blot驗(yàn)證各組單克隆細(xì)胞、單克隆無關(guān)序列細(xì)胞及Hca-P細(xì)胞株中CrkL蛋白的表達(dá)水平。2、CCK-8法測定CrkL下調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞增殖能力的影響;Transwell小室測定CrkL下調(diào)對(duì)Hca-

6、P細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響;3、小鼠足墊種植法分析CrkL下調(diào)對(duì)小鼠足墊成瘤性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果:1、設(shè)計(jì)了3條針對(duì)CrkL的siRNA，且成功構(gòu)建了3種重組質(zhì)粒:pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL-707、 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL-732和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL-560并篩選得到15株單克隆細(xì)胞株。Western blot結(jié)果表明:相對(duì)于陰

7、性對(duì)照組，在707-7、732-3和560-4單克隆細(xì)胞中CrkL在蛋白水平明顯下調(diào)，其下調(diào)率分別為63.34％、93.12％和96.15％，可作為后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。2、CCK-8細(xì)胞增殖檢測結(jié)果顯示707-7、732-3和560-4單克隆細(xì)胞在培養(yǎng)96 h時(shí)間點(diǎn)增殖迅速，顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05); Transwell小室細(xì)胞遷移和侵襲檢測結(jié)果顯示707-7、732-3和560-4單克隆細(xì)胞的遷移數(shù)及侵襲數(shù)明顯多于陰性對(duì)照組

8、(P＜0.05);3、體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CrkL下調(diào)促進(jìn)小鼠足墊的成瘤性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。
　　結(jié)論:1、成功構(gòu)建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL表達(dá)載體;獲得15株CrkL表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)且干擾效率不同的單克隆細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究CrkL在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用奠定了基礎(chǔ);2、CrkL下調(diào)能夠促進(jìn)Hca-P細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力;3、CrkL下調(diào)能夠促進(jìn)小鼠足墊的成瘤性及體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率;4、CrkL在肝癌細(xì)