NDRG1通過整合素β3調(diào)控肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制研究.pdf

1、背景及目的:
　　肝癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位居前列，我國是肝癌高發(fā)國家之一，其新發(fā)和死亡病例數(shù)約占全球一半。肝癌早期不易發(fā)現(xiàn)，就診時多處于中晚期，治療困難，轉(zhuǎn)移和復發(fā)是影響其預后的主要因素，因此尋找肝癌生物標志物包括腫瘤易感基因和轉(zhuǎn)移相關基因等成為腫瘤研究的熱點。本課題組前期實驗已經(jīng)證實了NDRG1能夠抑制肝癌細胞株BEL7402細胞侵襲遷移能力，NDRG1發(fā)揮抑癌作用的分子機制是本研究的重點。本項目旨

2、在尋找NDRG1調(diào)控的腫瘤轉(zhuǎn)移相關下游基因，并探索NDRG1通過Smad2/3通路調(diào)控整合素β3(ITGB3)的表達進而影響B(tài)EL7402細胞侵襲遷移能力的分子機制，為肝癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的線索。
　　方法:
　　1、通過PCR Array實驗檢測敲低NDRG1基因表達后肝癌細胞株BEL7402細胞和SMMC7721細胞中mRNA表達發(fā)生變化的腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因，尋找NDRG1發(fā)揮作用的可能下游基因。
　　2、應用West

3、ern Blot實驗驗證在BEL7402細胞和SMMC7721細胞中敲低NDRG1基因后可能下游基因的蛋白表達變化，鎖定ITGB3基因繼續(xù)進行深入研究。
　　3、Real-Time PCR檢測肝癌細胞系中ITGB3 mRNA表達情況，利用siRNA技術(shù)敲低BEL7402細胞中ITGB3基因的表達，并利用Real-Time PCR和Western Blot實驗驗證其敲低效果。
　　4、在BEL7402細胞中共轉(zhuǎn)染sh-NDRG

4、1和si-ITGB3后，利用Transwell遷移和侵襲實驗驗證整合素β3對NDRG1功能發(fā)揮的影響。
　　5、Western Blot實驗檢測在BEL7402細胞中敲低NDRG1后，TGF-β/Smad通路關鍵分子Smad2、Smad3及其磷酸化蛋白p-Smad2、p-Smad3的表達變化。
　　6、向轉(zhuǎn)染了sh-NDRG1的BEL7402細胞中加入TGF-β/Smad通路抑制劑SB431542，Western Blot實

5、驗驗證SB431542對NDRG1引起的整合素β3蛋白表達變化的影響，Transwell遷移和侵襲實驗驗證SB431542對NDRG1抑制BEL7402細胞遷移和侵襲能力的影響。
　　7、在BEL7402細胞中分別轉(zhuǎn)染si-Smad2、si-Smad3或通路共同調(diào)節(jié)蛋白si-Smad4，Real-Time PCR和Western Blot實驗驗證siRNA對目標基因的干擾效果，并進一步分別共轉(zhuǎn)染sh-NDRG1及si-Smad2、

6、si-Smad3或si-Smad4，驗證TGF-β/Smad通路關鍵蛋白分子分別對NDRG1調(diào)控整合素β3表達的影響。
　　結(jié)果:
　　1、PCR Array實驗表明敲低NDRG1基因后，CTSL1、IL-1β、ITGB3、MMP10、SERPlNE1基因在BEL7402細胞中表達顯著升高，MMP13、TNFSF10基因表達減少;而在SMMC7721細胞中，ETV4、ITGB3、MMP10、SERPINE1基因的表達量增加，

7、CDH6、TNFSF10基因的表達量降低。
　　2、Western Blot實驗證實，NDRG1敲低72h后，BEL7402細胞及SMMC7721細胞中整合素β3蛋白表達均上調(diào)。
　　3、ITGB3 mRNA在BEL7402細胞中的內(nèi)源性表達量最高，其次是HepG2細胞，在SMMC7721細胞中表達量最低;Real-Time PCR和Western Blot實驗結(jié)果表明si-ITGB3能有效干擾BEL7402細胞中整合素β3

8、的表達。
　　4、Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果說明敲低ITGB3后sh-NDRG1誘導的BEL7402細胞遷移和侵襲能力的增強被顯著抑制，NDRG1可能通過干擾整合素β3的表達抑制BEL7402細胞的遷移和侵襲熊力。
　　5、Western Blot實驗表明敲低NDRG1基因后，Smad2、p-Smad2及p-Smad3的表達上調(diào)。
　　6、通路抑制劑SB431542能夠阻礙sh-NDRG1介導的BEL7402

9、細胞中整合素β3的上調(diào)，并且能夠阻礙NDRG1對BEL7402細胞遷移和侵襲能力的調(diào)控，說明NDRG1可能通過TGF-β/Smad通路發(fā)揮抑制BEL7402細胞的遷移和侵襲能力的作用。
　　7、Real-Time PCR和Western Blot實驗表明si-Smad2、si-Smad3及si-Smad4均能有效干擾相應目標基因mRNA和蛋白的表達，且分別敲低Smad2、Smad3及Smad4均能阻礙NDRG1對整合素β3的調(diào)控作