整合素αvβ6調控結腸癌細胞肝臟轉移和侵襲性生長的實驗研究.pdf

1、結腸癌為目前常見的影響人類健康的惡性腫瘤之一.癌細胞侵襲浸潤性生長和遠隔器官轉移是惡性腫瘤區(qū)別于良性腫瘤的重要生物學特征，也是影響結腸癌預后的關鍵因素，如何抑制癌腫侵襲浸潤性生長以及如何控制結腸癌肝臟轉移是目前癌癥研究中最具有挑戰(zhàn)性的關鍵課題。大量研究資料證明，結腸癌的發(fā)生發(fā)展過程與細胞表面的生物學特性密切相關，是受細胞粘附分子和基質降解酶調控的，但是這些蛋白分子是如何在結腸癌肝臟轉移過程中發(fā)揮作用，如何調控結腸癌侵襲性生長，我們卻知之

2、甚少。 在癌細胞表面表達的粘附分子家族中，整合素家族是最具有特征性的，特別是整合素αvβ6在結腸癌細胞的表達模式與結腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。整合素αvβ6在健康成人上皮細胞不表達或極少表達，但是在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中卻誘導高表達。文獻報道：在口腔白斑病整合素αvβ6誘導表達而且是惡性變?yōu)轺[狀細胞癌的必須的前提條件；在口腔鱗狀細胞癌和結腸癌也觀察到整合素αvβ6的新生表達。前期研究證明：無論在體內還是在體外，整合素αvβ6促進了結腸

3、癌細胞的增殖和生長.此外，αvβ6可以誘導基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的分泌，通過提高對細胞周圍基質的降解，增強癌細胞的浸潤遷徙能力。不難想象，癌細胞能克服和逃避正常細胞擁擠和密度積壓障礙，而無限制的侵襲性生長和遠處轉移，可能是通過癌細胞的誘導表達αvβ6而介導MMP-9分泌實現(xiàn)的。本實驗的研究目的是探討αvβ6在調控結腸癌肝臟轉移和侵襲性生長方面的作用機制，為進行有關結腸癌的進一步研究提供全新的思路和理論基礎，有理由相信特異性針對

4、整合素αvβ6的靶向治療策略，對進展期結腸癌病人的治療將起到重要的作用。 第一部分:整合素αvβ6調控結腸癌細胞肝臟轉移和肝臟定植潛能的實驗研究目的結腸癌肝臟轉移是結腸癌特征性的惡性行為之一，整合素αvβ6與結腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，然而，整合素αvβ6在結腸癌細胞表面的表達程度與結腸癌肝臟轉移之間的關系我們知之甚少。 目的： 是探討整合素αvβ6與結腸癌細胞肝臟轉移和肝臟定植潛能的關系。 材料與方法

5、 1.免疫組織化學染色是本實驗檢測整合素αvβ6在結腸癌組織和肝臟轉移癌組織表達水平的重要方法，為了驗證免疫組化結果的特異性，首先選擇不同的結腸癌細胞系(WiDr細胞、SW480 wild細胞、SW480β6轉染細胞)采用免疫沉淀分析檢測單克隆抗體2G2(美國Biogen公司)的特異性。 2.隨機選擇63例的結腸癌肝臟轉移病人(1995年1月至2005年1月經(jīng)過手術治療)的肝臟轉移癌標本，用抗avp6的單克隆抗體2G2作為一

6、抗，采用Elivision法進行免疫組織化學染色。然后從2001年1月至2002年12月經(jīng)手術治療的結腸癌病人中，隨機選取結腸癌組織標本358例，構建成2張200點的組織芯片(在陜西超英生物公司制作)，采用ABC法進行αvβ6免疫組化染色，根據(jù)免疫組化結果(αvβ6陽性或者αvβ6陰性)，將手術后病人分為兩組，進行3年手術后肝臟轉移隨訪。 3.為了探討在進展期結腸癌中整合素αvβ6免疫反應性與癌細胞在肝臟定植和肝臟轉移的關系，我

7、們選用了肝臟定植實驗(肝臟組織內直接注射結腸癌WiDr轉染細胞)和肝臟轉移成瘤實驗(經(jīng)脾臟注射結腸癌HT29轉染細胞)。 4.為了探討整合素αvβ6調節(jié)結腸癌肝臟轉移的機制，分別用明膠酶譜法和Biotrak MMP-9活性分析系統(tǒng)檢測人工培養(yǎng)的結腸癌細胞(WiDr和HT29轉染細胞)的基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的分泌水平：同時采用Transwell小室侵襲實驗檢測不同結腸癌細胞(HT29和WiDr轉染細胞)的侵襲轉移能力。

8、 結論： 1.抗αvβ6單克隆抗體2G2特異性的識別結腸癌細胞表面的整合素αvβ6受體。 2.結腸癌肝臟轉移組織比結腸癌組織具有較高的αvβ6陽性表達率，整合素αvβ6陽性表達的結腸癌患者比αvβ6陰性患者具有較高的肝臟轉移率。說明結腸癌細胞的αvβ6的免疫反應性與結腸癌肝臟轉移密切相關。 3.結腸癌肝臟轉移的轉歸取決于結腸癌細胞表面的生物學特性及肝臟宿主器官微環(huán)境。整合素αvβ6有助于結腸癌細胞在肝臟的

9、定植存活，有助于增強癌細胞的肝臟轉移能力。 4.整合素αvβ6能促進MMP-9分泌，加快細胞外基質降解；整合素αvβ6能提高結腸癌細胞在纖維連接蛋白基質上的趨化遷移能力；二者構成了結腸癌肝臟轉移的先決條件。 第二部分 整合素αvβ6調控結腸癌細胞侵襲性生長機制的實驗研究目的結腸癌細胞的侵襲性生長是區(qū)別于結腸良性腫瘤的重要特征，也是影響預后的關鍵因素。 目的： 研究結腸癌在細胞高密度和細胞擠壓狀態(tài)對

10、結腸癌細胞表面整合素αvβ6表達的影響效果，探討αvβ6對結腸癌細胞分泌基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的影響，以及αvβ6對癌細胞侵襲性生長的影響，進一步揭示結腸癌細胞永生化侵襲性生長的分子機制。 材料與方法 1.用流式細胞儀檢測結腸癌細胞系WiDr和SW480細胞株以及正常人角質細胞系HaCaT細胞株，分別在高、低細胞密度培養(yǎng)條件下各細胞表面的αvβ6表達水平。 2.將100例結腸癌標本的腫瘤邊緣部分(癌細胞

11、密集相對高細胞密度)及腫瘤中心部分(癌細胞稀疏相對低細胞密度)制作成200點的組織芯片(陜西超英生物)，用免疫組織化學染色方法檢測分析整合素αvβ6在結腸癌不同部位的分布差異和表達強度區(qū)別。 3.用Biotrak MMP-9分析系統(tǒng)和明膠酶譜法分別測定不同的結腸癌WiDr細胞株和SW480細胞株，以及正常人角質細胞系HaCaT細胞株，在高、低細胞密度培養(yǎng)條件下，MMP-9的活性和分泌水平。 結論： 1.細胞高密度

12、和細胞擠壓狀態(tài)誘導癌細胞αvβ6表達，是結腸癌侵襲性生長的啟動子。 2.在結腸癌細胞，整合素αvβ6的表達呈密度依賴性增加的機制，與正常人上皮細胞不同。在高細胞密度培養(yǎng)條件下，結腸癌細胞MMP-9分泌量的增加也是由整合素αvβ6調控的，特異性的封閉整合素αvβ6受體可以減少癌細胞的MMP-9分泌水平。 3.細胞高密度誘導結腸癌細胞αvβ6持續(xù)表達，促進MMP-9的分泌，加速細胞外基質的降解，是構成結腸癌細胞永生化侵襲性生