牛卵母細胞抽提物對人肺癌細胞的表觀遺傳重編程作用研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴重危害人類健康與生命的一類疾病。傳統(tǒng)的腫瘤治療手段是使用手術(shù)切除病灶以及通過放療和化療殺滅腫瘤細胞。但是，手術(shù)難以切除微小播散病灶;放療與化療不僅缺乏特異性，使身體內(nèi)大量的正常細胞受到嚴重的損傷，而且具有加速腫瘤細胞進一步惡化的風險。因此，很有必要跳出以往著眼于移除和殺滅腫瘤細胞的思路，為腫瘤研究尋找新的方向、為腫瘤治療提供新的手段。
　　卵母細胞抽提物介導的表觀遺傳重編程是近年新發(fā)展起來的一種重編程方法。它使用卵母細

2、胞的核、質(zhì)或全細胞抽提物去孵育經(jīng)可逆通透的目標細胞，在孵育過程中，抽提物中的重編程因子可進入目標細胞中，使目標細胞的表觀遺傳修飾和基因表達模式發(fā)生改變，最終使其脫離原有的發(fā)育程序、獲得新的發(fā)育命運。研究表明，表觀遺傳調(diào)控紊亂在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。我們考慮，用卵母細胞抽提物作用于腫瘤細胞，有望改變腫瘤細胞的表觀遺傳修飾，使其脫離異常發(fā)育程序，重新獲得向正常細胞發(fā)育的能力。
　　本實驗首次使用牛的MII期、GV期和孤雌激

3、活卵母細胞抽提物處理H460人肺癌細胞，從表觀遺傳修飾、基因表達和細胞功能三個層面上觀察了卵母細胞抽提物對人肺癌細胞的重編程效應(yīng)。結(jié)果顯示:
　　1.牛卵母細胞抽提物能夠逆轉(zhuǎn)H460人肺癌細胞中抑癌基因啟動子區(qū)CpG島超甲基化
　　牛MII期、GV期和孤雌激活卵母細胞抽提物處理H460細胞，均能使抑癌基因RUNX3和CDH1超甲基化的啟動子區(qū)CpG島發(fā)生顯著去甲基化，其中RUNX3啟動子區(qū)CpG島的DNA甲基化水平分別降低了

4、30.44％、40.29％和33.81％，CDH1啟動子區(qū)CpG島的DNA甲基化水平分別降低了36.36％、42.57％和39.36％。不同發(fā)育期卵母細胞抽提物誘導的去甲基化都不是在兩CpG島內(nèi)各CpG位點上均勻發(fā)生，而是更多的集中在一些特定的CpG位點上;位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列內(nèi)的CpG位點具有較高的去甲基化率。
　　2.牛卵母細胞抽提物能夠改變H460人肺癌細胞中抑癌基因啟動子區(qū)組蛋白修飾模式
　　牛MII期、GV期和孤雌

5、激活卵母細胞抽提物處理H460細胞，均能降低抑癌基因RUNX3和CDH1啟動子區(qū)抑制性組蛋白修飾H3K27me3和H3K9me3的水平，其中MII期卵母細胞抽提物降低H3K27me3修飾水平的能力最強，不同發(fā)育期卵母細胞抽提物降低H3K9me3修飾水平的能力相當;MII期卵母細胞抽提物對RUNX3和CDH1啟動子區(qū)活化性組蛋白修飾H3K9ac和H3K4me3的水平均無影響，GV期卵母細胞抽提物可升高RUNX3啟動子區(qū)H3K9ac和H3K

6、4me3修飾的水平以及CDH1啟動子區(qū)H3K9ac修飾的水平，孤雌激活卵母細胞抽提物可升高RUNX3和CDH1啟動子區(qū)H3K4me3修飾的水平。
　　3.牛卵母細胞抽提物能夠激活H460人肺癌細胞中抑癌基因的表達
　　牛MII期、GV期和孤雌激活卵母細胞抽提物處理H460細胞，均能激活抑癌基因RUNX3和CDH1的表達。兩基因的轉(zhuǎn)錄動態(tài)變化在不同處理組中具有差異，MII期卵母細胞抽提物處理組中RUNX3和CDH1的轉(zhuǎn)錄水平在

7、培養(yǎng)6h時即大幅升高，6h后至48 h時又略有升高;GV期和孤雌激活卵母細胞抽提物處理組中RUNX3和CDH1的轉(zhuǎn)錄水平在培養(yǎng)6h時升幅較小，6h后至48 h時大幅升高。培養(yǎng)48 h時，不同發(fā)育期卵母細胞抽提物處理組間RUNX3和CDH1的轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異。
　　各發(fā)育期卵母細胞抽提物處理組中RUNX3和CDH1的蛋白表達均從培養(yǎng)24 h時開始被激活。
　　4.牛卵母細胞抽提物對抑癌基因的作用具有特異性
　　牛MII

8、期、GV期和孤雌激活卵母細胞抽提物對H460細胞中抑癌基因RUNX3和CDH1的表觀遺傳重塑和轉(zhuǎn)錄激活均具有特異性。它們都不引起重復(fù)序列alpha satellite和retroviral long terminal repeat sequence of minisatellite MS32的去甲基化，也不上調(diào)多能性基因OCT4、NANOG、KLF4和SOX2的轉(zhuǎn)錄。孤雌激活卵母細胞抽提物還可使多能性基因SOX2啟動子區(qū)的抑制性組蛋白修

9、飾H3K27me3增多，活化性組蛋白修飾H3K9ac減少，進而下調(diào)SOX2的表達。
　　5.牛卵母細胞抽提物能夠抑制H460人肺癌細胞的惡性表型
　　牛MII期、GV期和孤雌激活卵母細胞抽提物均能顯著抑制H460細胞的惡性表型。與對照組細胞相比，三個處理組細胞的增殖能力分別降低了24.88％、26.42％和26.38％，錨定非依賴型生長能力分別降低了60.56％、53.18％和54.71％，遷移能力分別降低了40.72％、4

10、6.93％和35.20％，侵襲能力分別降低了78.05％、83.33％和73.81％。
　　結(jié)論
　　牛MII期、GV期和孤雌激活卵母細胞抽提物處理H460人肺癌細胞，均能使抑癌基因啟動子區(qū)超甲基化的CpG島發(fā)生顯著去甲基化，并重塑抑癌基因啟動子區(qū)的組蛋白修飾模式，從而激活抑癌基因的表達。牛卵母細胞抽提物對抑癌基因的作用具有特異性，并不引起重復(fù)序列的去甲基化以及多能性基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)。最終癌細胞的增殖、錨定非依賴型生長、遷移和